以標(biāo)準(zhǔn)煎劑為基準(zhǔn)建立夏枯草配方顆粒特征圖譜的方法

農(nóng)新維，楊梅，黃雄梅，鄧慧連，王嬋，周堅(jiān)

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成的中藥顆粒劑。隨著《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》的公布，配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)研究有了明確規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為衡量配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)參照物，配方顆粒藥效物質(zhì)應(yīng)與中藥飲片水煎湯劑保持基本一致。因此，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑作比對(duì)研究，成為了中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)制定的重要前提。夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，具有清肝瀉火，明目，散結(jié)消腫的功效[1]。目前夏枯草報(bào)道主要集中在藥材和配方顆粒[2-8]的單獨(dú)研究，但其飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了夏枯草飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的HPLC特征圖譜，對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為夏枯草配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司），XPE205DR電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

迷迭香酸（批號(hào)111871-201102，純度99.8%）、咖啡酸（批號(hào)110885-200102，純度100%）、原兒茶醛（110810-200205，純度100%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹參素（批號(hào)MUST-18060920，純度98.38%）購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。15批夏枯草飲片、4批夏枯草配方顆粒由培力（南寧）藥業(yè)有限公司提供；15批夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》相關(guān)要求制備，編號(hào)及藥材具體來源見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MGII（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～22 min，10%→22%A；22～37 min，22%A；37～62 min，22%→38%A；62～65 min，38%→90%A；65～70 min，90%A）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液…精密稱取迷迭香酸、咖啡酸、原兒茶醛、丹參素對(duì)照品適量，用50%乙醇制成濃度分別為87.36，11.55，17.78，79.30 μg · mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 飲片供試品溶液…取夏枯草飲片粉末（過二號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，稱重，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液…稱取夏枯草飲片100 g，加18倍水浸泡30分鐘，武火煮沸后改文火煎煮20分鐘，濾過；加16倍水煎煮25分鐘，濾過，合并2次水煎液，于50 ℃以下減壓濃縮，真空冷凍干燥制得凍干膏粉。取該凍干膏粉適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 配方顆粒供試品溶液…取夏枯草配方顆粒適量，研細(xì)。稱取細(xì)粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱重，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 配方顆粒陰性對(duì)照溶液的制備…取按處方比例及制備工藝制得的不含夏枯草的陰性對(duì)照樣品，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性及專屬性實(shí)驗(yàn)…分別精密吸取混合對(duì)照品、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，進(jìn)樣分析，見圖1。結(jié)果表明，樣品中各個(gè)峰分離較好，峰形對(duì)稱，且陰性無干擾，該方法專屬性良好。

圖1 夏枯草配方顆粒HPLC特征圖譜

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)…取同一份配方顆粒供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以4號(hào)峰為S峰，計(jì)算1～5號(hào)特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.20%～0.25%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)…取同一份配方顆粒供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，以4號(hào)峰為S峰，計(jì)算1～5號(hào)特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.10%～0.23%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)…按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備6份配方顆粒供試品溶液，按擬定方法測(cè)定，以4號(hào)峰為S峰，計(jì)算1～5號(hào)特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.11%～0.30%，表明方法重復(fù)性較好。

2.3.5 耐用性實(shí)驗(yàn)…取夏枯草配方顆粒供試品溶液，在原色譜條件基礎(chǔ)上，采用不同檢測(cè)柱溫（30±5）℃、流速（1.0±0.1）mL·min-1測(cè)定同一供試品溶液，考察色譜條件的耐用性。以4號(hào)峰為S峰，計(jì)算1～5號(hào)特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果在不同柱溫、流速下，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.19%～2.71%、0.61%～2.74%，表明方法柱溫及流速耐用性較好。

2.4 特征圖譜的建立

按照擬定方法分別對(duì)15批夏枯草飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、4批配方顆粒進(jìn)行測(cè)定，并建立了HPLC特征圖譜，見圖2～5。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行Mark峰匹配。共選擇了5個(gè)重復(fù)性較好的峰作為共有特征峰。由圖1可知，通過與對(duì)照品色譜圖比較，峰1為丹參素，峰2為原兒茶醛，峰3為咖啡酸，峰4為迷迭香酸。以4號(hào)峰為S峰，計(jì)算1～5號(hào)特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見表2。

圖2 15批夏枯草飲片HPLC特征圖譜及其對(duì)照指紋譜

圖3 15批夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC特征圖譜及其對(duì)照指紋譜

圖4 4批夏枯草配方顆粒HPLC特征圖譜及其對(duì)照指紋譜

圖5 夏枯草飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒HPLC特征圖譜比較

表2 各對(duì)照特征圖的譜相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

標(biāo)準(zhǔn)湯劑 0.318 0.175 0.693 1.000 0.250配方顆粒 0.297 0.183 0.465 1.000 0.210

2.5 飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒相關(guān)性研究

由圖2～5、表2的結(jié)果分析，飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒均呈現(xiàn)1～5號(hào)共有特征峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，相對(duì)峰面積較為接近，且三者相似度在0.987～0.996，說明飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒具有良好的相關(guān)性，配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑在化學(xué)成分上具有一致性，可為中藥配方顆粒替代傳統(tǒng)湯劑的可行性提供了重要依據(jù)。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件選擇

通過對(duì)供試品的190～400 nm全波長(zhǎng)掃描顯示，在280 nm處色譜峰數(shù)量較多，信息豐富，且峰形及分離度良好，選擇了280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。分別采用了水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇對(duì)配方顆粒進(jìn)行超聲提取，結(jié)果50%乙醇峰形較好，響應(yīng)值較高，故選擇50%乙醇溶液作為提取溶劑。

3.2 特征峰指認(rèn)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)5號(hào)特征峰進(jìn)一步研究，經(jīng)質(zhì)譜解析和文獻(xiàn)查閱，鑒定為荊芥素A（schizotenuin A），因未能購(gòu)到對(duì)照品，不能進(jìn)行對(duì)照品定位，故未將峰5進(jìn)行成分歸屬。

3.3 相關(guān)性分析

建立了夏枯草配方顆粒的 HPLC 指紋圖譜，方法簡(jiǎn)單、快捷，夏枯草飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒特征圖譜相似度高、化學(xué)成分基本一致，具有可追溯性，可全面對(duì)夏枯草配方顆粒生產(chǎn)過程中各環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制，為其質(zhì)量控制提供了有效手段及依據(jù)。