四物湯中多糖水提工藝的優(yōu)化研究

周菲，江華娟，何瑤，姬夢姣

四物湯是中醫(yī)補血之經(jīng)典基礎(chǔ)方劑，東漢張仲景所著《金匱要略》中的膠艾湯除去阿膠、艾葉、甘草后即為四物湯。四物湯最早收載于唐代藺道人所著的《仙授理傷續(xù)斷秘方》，用于治療外傷淤血疼痛；后收載于我國第一部官方制劑規(guī)范《太平惠民和劑局方》，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、惡露不止等婦人諸證[1-2]。全方四味藥組成，熟地黃為君藥，可滋養(yǎng)陰血，補腎填精；當歸為臣藥，可補血養(yǎng)肝、活血調(diào)經(jīng)；白芍為佐藥，可和營養(yǎng)肝；川芎為使藥，可活血行滯[3]。

現(xiàn)代研究表明，多糖是中藥發(fā)揮藥效作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，參與機體的生理代謝，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗突變、抗輻射等多種生物活性[4-5]。四物湯中含有大量多糖類成分，是其主要有效部位之一，具有補血、促進小鼠腹腔巨噬細胞釋放細胞因子等作用[6-8]。目前四物湯多糖的研究主要集中在四物湯中單味藥多糖藥效作用的研究，研究指出方中熟地黃多糖可增強機體免疫能力，同時還具有抗氧化、抗突變等多種作用[9-10]；當歸多糖具有較好的抗腫瘤、促進造血功能和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[11-12]；白芍多糖具有增強免疫、抗腫瘤、抗糖尿病等作用[13-14]；川芎多糖則具有較強的抗氧化活性[15-16]。四物湯作為一個復方，復方多糖中多糖的配伍或相互影響使得多糖的作用更加多樣化，其多糖的生物學效應也表現(xiàn)在更多方面，而目前四物湯復方多糖的藥效、制備工藝和質(zhì)量控制研究卻少見報道。在中藥制劑研究中，藥物適合的制備工藝和嚴格的質(zhì)量控制是準確研究藥效的基礎(chǔ)，中藥復方成分復雜多樣，其含量和結(jié)構(gòu)會隨著提取工藝的不同而發(fā)生一定變化，為了更深入、更準確的研究四物湯多糖，筆者建立了用紫外分光光度法測定四物湯復方多糖的含量測定方法，并以多糖含量為評價指標，采用L9(34)正交試驗法優(yōu)選四物湯多糖的水提工藝條件，為四物湯多糖的進一步研究開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-6100型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；DZF-1B型真空干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；DGG-9030型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JJ600Y型電子天平（常熱市雙杰測試儀器廠）；BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；DL-720D數(shù)控超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。

1.2 試藥

D(+)-無水葡萄糖（批號：MUST-16012910，純度99.85%），購于成都曼斯特生物科技有限公司；濃硫酸、苯酚、無水乙醇、乙醇、丙酮、乙醚均為分析純,均購于成都市科隆化學品有限公司。

熟地黃飲片（產(chǎn)地：河南，批號：G02717J01）、當歸飲片（產(chǎn)地：甘肅，批號：G02617M01）、白芍飲片（產(chǎn)地：安徽，批號：G01217P01）、川芎飲片（產(chǎn)地：四川，批號：G02217H01），均購于四川中庸藥業(yè)有限公司。經(jīng)鑒定，依次來源于玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的干燥塊根炮制品；傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels. 的干燥根；毛莨科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根；傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，均符合《中國藥典》2015年版相關(guān)項下要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗多糖的含量測定

2.1.1 溶液的制備…對照品溶液的配制：精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10 mg置100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，并用蒸餾水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 μg．mL-1的對照品儲備液。分別精密吸取上述對照品儲備液1,2,3,4,5,6 mL，各自置于10 mL的容量瓶中，并分別加蒸餾水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為10,20,30,40,50,60 μg．mL-1系列濃度的葡萄糖對照品溶液。另取2 mL蒸餾水作為空白調(diào)零。

5%苯酚試劑的配制: 稱取精制苯酚5.0 g,加蒸餾水溶解并定容至100 mL，混勻，即得5%苯酚試劑，置于棕色瓶中備用。

供試品溶液的制備：取熟地黃、白芍、當歸、川芎各10 g,將中藥材飲片粉碎成粗顆粒（其中熟地黃剪碎）,加水浸泡0.5 h,按因素水平表加入一定量水加熱煎煮一段時間，濾過，合并濾液，將濾液減壓濃縮至相對密度為1.05～1.10（60℃），加入適量乙醇，使含醇量達到80%，在冷處靜置12 h，濾過，沉淀用丙酮、乙醚、無水乙醇依次反復沖洗，真空干燥，稱重。精密稱取上述干燥至恒重的沉淀物40 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，搖勻，并定容至刻度，從50 mL容量瓶中精密量取3 mL置20 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.2 標準曲線的制備…分別取葡萄糖對照品系列溶液1 mL，各自置于10 mL具塞試管中，分別加入5%苯酚試劑1 mL,再迅速滴加濃硫酸5 mL，立即充分搖勻，蓋上玻璃塞，室溫放置30 min。以1 mL蒸餾水同上操作作為空白對照，按紫外分光光度法在490 nm波長處測定吸光度(A)。以吸光度(A)為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程為：Y=0.01523X+0.06867，r=0.9980(n=6)，結(jié)果表明葡萄糖在10～60 μg．mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗…取“2.1.1”項下方法制備的同一份葡萄糖對照品溶液1 mL，按照“2.1.2”項下方法測定吸光度，連續(xù)測定6次，測得吸光度的RSD值為0.27%，表明該方法精密度良好。

2.1.4 重復性試驗…按照“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，精密量取1 mL，按照“2.1.2”項下方法測定吸光度，測得多糖含量的RSD值為2.25%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗…按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，按照“2.1.2”項下方法分別于30,60,90,120,150,180 min測定吸光度，測得多糖含量的RSD值為0.52%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.1.6 加樣回收率實驗…精密吸取6份已知葡萄糖含量的供試品溶液1 mL,置于10 mL具塞試管中，分別精密加入10,20,30,40,50,60 μg．mL-1葡萄糖對照品溶液1 mL，按照“2.1.2”項下方法測定吸光度,測得多糖的平均加樣回收率為100.09%，RSD值為2.05%，結(jié)果表明該方法回收率良好，結(jié)果見表1。

2.2 正交試驗優(yōu)化提取工藝

2.2.1 正交實驗設(shè)計…取熟地黃、白芍、當歸、川芎飲片各10 g，共9份，以提取時間(A)、料液質(zhì)量比(B)和提取次數(shù)(C)為考察因素，以多糖含量作為評價指標，按L9(34)正交表進行試驗，測定多糖含量。對試驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析，篩選四物湯多糖的最佳水提工藝條件，因素水平見表2，正交試驗結(jié)果及直觀分析結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 水提工藝正交試驗因素水平

表3 水提工藝正交試驗結(jié)果

K1 147.30 134.66 80.68 161.62 K2 147.93 165.07 186.94 177.05 K3 189.37 184.87 216.98 145.93 R 14.02 16.74 45.43 10.37

表4 水提工藝正交試驗方差分析表

從直觀分析的極差大小來看，各因素對四物湯多糖提取工藝的影響因素主次分別為:C＞B＞A，即提取次數(shù)對多糖含量影響最為明顯，其次為料液質(zhì)量比和提取時間。從各因素不同水平綜合評分的均值大小來看，因素A的優(yōu)劣次序為3＞2＞1，因素B的優(yōu)劣次序為3＞2＞1，因素C的優(yōu)劣次序為3＞2＞1。

從方差分析結(jié)果來看,因素C的P值小于0.05,說明因素C對四物湯多糖的提取具有顯著性影響；考慮省時降耗及實際生產(chǎn)情況,確定四物湯多糖的最佳水提工藝條件為A1B2C3,即加入8倍量水，回流提取1h，共提取3次。

2.2.2 工藝驗證…為了進一步驗證所選提取工藝的科學性與穩(wěn)定性，取熟地黃、白芍、當歸、川芎飲片各10 g，共3份，按正交實驗優(yōu)選出的最佳水提工藝條件A1B2C3提取四物湯多糖，制得樣品后按照“2.1.2”項下方法測定其吸光度，并通過標準曲線計算多糖的含量。結(jié)果顯示3次實驗測定值基本平行，多糖含量分別為71.31、69.58、70.59 mg．g-1，平均含量為70.49 mg．g-1，驗證實驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本吻合，表明該工藝合理、穩(wěn)定性好，可行性高。

3 討論

本實驗采用正交設(shè)計來優(yōu)化四物湯多糖的提取工藝[17]。多糖的提取方法較多，常規(guī)的提取方法有溶劑提取法、超聲提取法、超高壓提取法、微波法等，其中溶劑提取法最為常用，提取媒介有水、酸、堿等[18]。根據(jù)相似相溶原理，水是較好的提取媒介，且考慮到提取方法的操作和設(shè)備要求，故本次實驗采用水煎法進行四物湯多糖的提取。在純化多糖時，考慮到多糖難溶于一定體積分數(shù)的乙醇，課題組通過預實驗發(fā)現(xiàn)當含醇量達到80%時多糖的沉淀效果最佳，沉淀較為完全，故本次實驗采用在提取液中加入乙醇使含醇量達到80%來沉淀多糖。

測定多糖含量的方法主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、高效液相色譜法、酶法等。高效液相色譜法與酶法因測定時間較長、測定成本較高等原因，不被廣泛使用；而苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法檢測迅速、實用性強，現(xiàn)已廣泛應用于多糖的含量測定研究中[19-21]。實驗中課題組考慮到蒽酮-硫酸法易受蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾，故本次實驗采用苯酚-硫酸法來測定多糖的含量。該法操作簡單、靈敏度高，且基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，能有效地測定四物湯中多糖的含量。

多糖是一類重要的天然活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等眾多生物活性，且對機體毒副作用小，來源廣泛。目前，多糖的研究多集中在藥效方面，而多糖的提取工藝、含量測定、構(gòu)效關(guān)系等方面的研究還有待深入。藥物的制備工藝和質(zhì)量控制極其重要，不同的制備工藝會引起藥物化學成分結(jié)構(gòu)和含量的改變，從而影響藥物的藥理活性。四物湯作為一個補血調(diào)經(jīng)的名方，近年來關(guān)于四物湯復方多糖的研究卻鮮有報道，其在制備工藝、質(zhì)量控制和藥效研究等方面還存在很大研究空間。本文以四物湯多糖的含量測定和提取工藝為研究點，建立了用紫外分光光度法測定四物湯多糖的含量測定方法，優(yōu)選出了四物湯多糖的最佳提取工藝，實驗結(jié)果表明，建立的含量測定方法簡便可靠，穩(wěn)定，重復性好，靈敏度高；優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定合理，重復性好，可行性高，該方法和工藝條件為四物湯多糖的制備和質(zhì)量控制提供了參考，亦為以后四物湯多糖的藥效等深入研究提供了相關(guān)依據(jù)。