中空纖維膜液相微萃取-超高效液相色譜測定蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯中兩種生物堿

寶貴榮, 孟 和, 李優(yōu)鑫, 包建民*

(1. 呼和浩特職業(yè)學(xué)院生物化學(xué)工程學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051; 2. 天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 天津 300072; 3. 內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯是在蒙醫(yī)臨床中常用的傳統(tǒng)蒙藥制劑,是由光明鹽、訶子、蓽茇和干姜各125 g組成的散劑。毛勒日-達(dá)布斯-4湯制劑通常是淺棕黃色至棕黃色粉末,具有溫胃、消食、解毒的功效。臨床常用于治療消化不良、胃脹、藥物中毒和食物中毒等。蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯的主要活性成分為胡椒堿和蓽茇寧,準(zhǔn)確測定這些活性成分有助于該蒙藥走向現(xiàn)代化。雖然已有報道[1,2]用HPLC方法測定蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯中胡椒堿的含量,但該方法靈敏度不高。特別是當(dāng)這些活性物質(zhì)處于復(fù)雜樣品基質(zhì)中且又是痕量的時候,就需將分離、富集等樣品前處理技術(shù)與定量檢測技術(shù)(如液相色譜)結(jié)合起來,以增加檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。因此,有必要開發(fā)更加廣泛應(yīng)用的樣品前處理技術(shù)并同時測定胡椒堿和蓽茇寧的分析方法。

中空纖維膜液相微萃取(HF-LPME)技術(shù)是集采樣、萃取和濃縮于一體的樣品前處理方法。該技術(shù)具有微量、快速、環(huán)境友好、操作簡便、廉價等優(yōu)勢,克服了傳統(tǒng)樣品前處理的諸多不足[3],廣泛應(yīng)用于藥品、環(huán)境等領(lǐng)域微痕量成分的分析測定[4]。HF簡便易得,在分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但是HF種類太多,材質(zhì)、直徑大小、壁厚、空隙率等的不同都會影響最終的萃取效果。正是因?yàn)镠F這種多樣性,到目前為止,尚無一家商業(yè)化的液相微萃取裝置可以采購。這種非商業(yè)化限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此,搭建HF-LPME裝置成了該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本文介紹一種實(shí)驗(yàn)室自制裝置,將移液槍的槍頭剪短后用環(huán)氧樹脂膠粘在HF和瓶蓋之間,制成半自動化的HF-LPME裝置,用于監(jiān)測蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯時的樣品前處理,與UPLC聯(lián)用,測定蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯中胡椒堿和蓽茇寧的含量。同時考察了影響HF-LPME效率的參數(shù),并優(yōu)化了色譜條件。此方法操作簡便、靈敏度高,可顯著提高檢出限,為蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯中生物堿的分析提供了新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY UPLC、ACQUITY Ultra Performance二極管陣列檢測器(PDA)、Milli-Q超純水裝置(美國Millipore公司), KQ-300VDE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), AnkeTDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。偏氟乙烯HF1(簡稱PVDF1, i. d. 1.57 mm, o. d. 1.96 mm, 23%空隙率)和偏氟乙烯HF(簡稱PVDF, i. d. 1.60 mm, o. d. 2.02 mm, 54%空隙率)購于安徽百奧秘科生物醫(yī)藥研究院,聚丙烯HF(簡稱PPHF, i. d. 0.50 mm, o. d. 0.80 mm, 0.2 μm空隙率)購于天津工業(yè)大學(xué)。

蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)院提供;胡椒堿(純度98.0%)購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院;蓽茇寧(純度99.0%)由內(nèi)蒙古大學(xué)蒙藥化學(xué)研究所提供;甲醇和乙腈(均為色譜純)購自天津大學(xué)科威公司;其他試劑均購自天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)公司。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確稱取20 mg胡椒堿和10 mg蓽茇寧對照品,用無水甲醇溶解并定容至50 mL,得到胡椒堿和蓽茇寧的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃冰箱避光保存。工作溶液由標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至所需濃度。

樣品制備:取蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯散劑,研細(xì),過80目篩子,取0.40 g,用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇超聲(270 W, 45 kHz)提取40 min后冷卻,定容至25 mL,揺勻后轉(zhuǎn)至塑料離心管中,以4 000 r/min的速度離心15 min,吸取上清液,過濾膜。

1.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司);柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為2 μL;流動相為乙腈和水(45∶55, v/v);流速為0.18 mL/min;檢測波長為338 nm。

1.4 HF-LPME

自制的HF-LPME裝置見圖1。將HF剪成30 mm長,放入甲醇中超聲清洗,自然晾干。將HF的一端加熱封死,另一端連接在移液槍的槍頭外部。為了避免HF脫落,使用環(huán)氧樹脂膠粘在HF與槍頭之間,槍頭的另一端剪短后固定在樣品瓶蓋的中間部位,并用微量注射器注入25 μL正辛醇。取1.8 mL樣品溶液加入HPLC自動進(jìn)樣瓶中,將含正辛醇的HF放入此小瓶。在室溫以173 r/min的速度振蕩萃取128 min。萃取完畢,用微量注射器抽回5 μL正辛醇,并放入干凈的HPLC自動進(jìn)樣瓶中,在37 ℃用氮?dú)獯蹈?。殘渣?00 μL的甲醇復(fù)溶后過濾,濾液和給體相用UPLC分析。

圖 1 HF-LPME裝置Fig. 1 Hollow fiber liquid phase micro-extraction(HF-LPME) device

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

對UPLC流動相的比例和流速進(jìn)行考察,結(jié)果見表1。以分離度最佳為選擇標(biāo)準(zhǔn),選擇流動相為乙腈和水(45∶55, v/v),流速為0.18 mL/min。

表 1 流動相體積比及流速對保留時間和分離度的影響

2.2 HF-LPME條件的優(yōu)化

2.2.1HF的選擇

HF具有疏水性,并有一定的機(jī)械強(qiáng)度[5]。為得到更好的萃取效率,對3種HF(PVDF1、PVDF和PPHF)進(jìn)行了篩選。結(jié)果(見圖2a)表明,空隙率>50%的PVDF萃取效率最高,因此本試驗(yàn)選用PVDF做HF。

圖 2 HF-LPME條件的優(yōu)化(n=5)Fig. 2 Optimization of HF-LPME conditions (n=5)a. selection of hollow fiber; b. selection of extraction solvent; c. selection of salt mass concentration; d. selection of extraction time. PVDF: polyvinylidence fluoride HF; PPHF: polypropylene HF.

2.2.2有機(jī)溶劑的選擇

HF-LPME中選擇合適的有機(jī)溶劑至關(guān)重要。有機(jī)溶劑不僅要與HF有良好的親和力,且需具有疏水性、低揮發(fā)性以及適當(dāng)?shù)酿ざ萚6,7]?？疾炝苏〈肌⒄齑?、正己醇、正己烷、正辛醇等有機(jī)溶劑對藥物萃取效率的影響,結(jié)果見圖2b。正辛醇的萃取效率最好,其次是正己烷,但正己烷易揮發(fā)。因此,選用正辛醇為萃取溶劑。

2.2.3離子強(qiáng)度的選擇

HF-LPME中有機(jī)溶劑和樣品溶液之間的分配系數(shù)受樣品基體的影響,樣品溶液中加入無機(jī)鹽可增強(qiáng)溶液的離子強(qiáng)度[8]。通過向樣品溶液中加入0～20 g/L的氯化鈉來考察離子強(qiáng)度對胡椒堿和蓽菝寧萃取效率的影響,結(jié)果見圖2c。結(jié)果表明,目標(biāo)物的峰面積隨氯化鈉質(zhì)量濃度的增加而增加,氯化鈉質(zhì)量濃度為10 g/L時達(dá)到了最高值,隨后峰面積逐漸降低,因此選擇在樣品溶液中加入10 g/L的氯化鈉。

2.2.4萃取時間的選擇

HF-LPME是基于物質(zhì)傳質(zhì)速率和萃取分配平衡的過程。萃取達(dá)到平衡時,待測物的萃取效率最高[9,10],但萃取時間過長,有機(jī)溶劑揮發(fā)且溶解,影響萃取效率。本文考察了萃取時間對胡椒堿和蓽菝寧萃取效率的影響,結(jié)果見圖2d。隨著萃取時間的增加,萃取效率增加,萃取2 h時基本達(dá)到平衡。綜合考慮,選擇萃取時間為128 min。

2.3 方法學(xué)研究

在優(yōu)化條件下,分析線性范圍、檢出限、重現(xiàn)性,計算加標(biāo)回收率。配制不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。胡椒堿和蓽菝寧分別在100～8 500和8.3～5 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)大于0.996 7。按照3倍信噪比和10倍信噪比確定化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表2。胡椒堿和蓽菝寧的檢出限為2.2和2.5 μg/L,定量限為7.3和8.3 μg/L,日間精密度為5.8%和7.8%,日內(nèi)精密度為2.6%和3.1%。分別取20、250和500 μg/L 3個水平的加標(biāo)樣品溶液,在最佳HF-LPME萃取條件下平行測定5次,用外標(biāo)法計算胡椒堿和蓽菝寧含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法重現(xiàn)性良好。

表 2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限、定量限、富集倍數(shù)(EF)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

a. 500 μg/L aqueous solutions were measured every 2 h in a day (n=5); b. 500 μg/L aqueous solutions were measured once a day (keep away from light) (n=5).

圖 3 胡椒堿和蓽菝寧標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的UPLC譜圖Fig. 3 UPLC chromatograms of piperine and piperlonguminine standard solution and sample solution

將本方法與蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯中胡椒堿含量測定方法[1,2]相比較,結(jié)果表明,該方法的檢測限優(yōu)于文獻(xiàn)報道的結(jié)果。

2.4 實(shí)際樣品分析

取3批樣品,按1.2節(jié)方法制備樣品溶液。在優(yōu)化條件下,以外標(biāo)法測定并計算樣品中胡椒堿和蓽茇寧的含量。蒙藥毛勒日-達(dá)布斯-4湯中胡椒堿和蓽菝寧的含量分別為(80±1.28) μg/L和(4.16±0.36) μg/L, RSD均小于6.6%(n=3)。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的色譜圖見圖3。

3 結(jié)論

本文通過對色譜條件和液相微萃取條件的優(yōu)化,建立了HF-LPME-UPLC聯(lián)用測定蒙藥勒日-達(dá)布斯-4湯中2種生物堿含量的方法。本方法操作簡便、靈敏度高、具有富集倍數(shù)高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),可廣泛用于蒙藥中胡椒堿和蓽菝寧的同時測定。