超高效液相色譜-大氣壓化學電離-三重四極桿質譜法同時測定保健食品中14種性激素類藥物

饒雅琨, 李 卓, 張荻悅, 董曼曼, 衛(wèi)星華, 陳 冬, 張亞鋒

(西安市食品藥品檢驗所, 陜西 西安 710054)

性激素類藥物,包括天然性激素和具有類似生物活性的半合成或全合成化合物,其結構母核多為環(huán)戊烷多氫菲,根據(jù)作用可分為雌激素、孕激素和雄激素。雌激素可減輕絕經(jīng)期綜合征的癥狀,也可用于治療痤瘡及老年性骨質疏松[1];有文獻[2]報道,雌激素對老年人具有增強記憶力的作用。孕激素在臨床上多用于避孕,可與雌激素合并用藥用于絕經(jīng)期后替代治療[3]。雄激素具有同化蛋白質的作用,能促進骨骼肌發(fā)育[4]和骨質合成[5],以及治療男性性功能減退。隨著年齡的增長,性激素分泌水平降低,人體表現(xiàn)出代謝減慢、脂肪增加、記憶力和精力減退、植物神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、骨質疏松、糖尿病高血脂等疾病加重的癥狀[6]。在臨床上,補充性激素類藥物有嚴格的適應證和禁忌證,擅自不合理地攝入性激素,會引起內分泌失調、新陳代謝紊亂，以及增加罹患癌癥的風險[7]。

近年來,隨著保健品市場的迅速發(fā)展,出現(xiàn)了許多祛除斑痕、改善更年期癥狀、延緩衰老、增強體力的保健品。一些不法商販為了追求經(jīng)濟利益,非法添加性激素類藥物,消費者服用這些藥物會嚴重擾亂機體正常代謝,危害身體健康,長期服用甚至危及生命安全。因此,應建立測定保健品中非法添加性激素類藥物的方法。

目前國內有關保健食品中性激素類藥物測定的報道較少,多為氣相色譜-質譜法[8,9]和液相色譜-質譜法[10-12],前者的樣品前處理需要衍生化[8,9],操作復雜,耗時長;后者涉及的樣品種類[10]或化合物種類[11]較單一,且離子源均采用ESI源[10-12],未考慮離子化方式對化合物響應的影響。本研究采用固相萃取方法處理樣品,以大氣壓化學電離(APCI)為離子化方式,建立了超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-MS/MS)同時測定保健食品中14種性激素類藥物的方法,并檢測了部分市售保健食品。所建方法前處理步驟簡單高效,穩(wěn)定性好,靈敏度高,適用性好,對保健食品中性激素類藥物非法添加的判定提供了重要的參考價值,為監(jiān)督機構及消費者提供了技術依據(jù),也促進保健食品市場的進一步規(guī)范化。本研究采用APCI作為離子化方式,可對其他研究工作中測定結構類似化合物時離子源的選用給予一定參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000-TSQ Quantiva型超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(美國賽默飛世爾科技公司),配有APCI源和TraceFinder定量處理軟件;HC-3018R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司); Milli2Q型超純水器(美國Millipore公司); MS105、ME204E型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

乙腈和甲醇(色譜純,德國Merck公司);氯化鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司); Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國Waters公司)。

圖 1 14種性激素類藥物的化學結構式Fig. 1 Chemical structures of 14 sexual hormones

對照品:己烯雌酚(diethylstilbestrol,純度99.9%)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate,純度100%)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate,純度99.2%)、炔諾酮(norethindrone,純度99.4%)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate,純度99.6%)、米非司酮(mifepristone,純度99.5%)、甲基睪丸酮(methyltestosterone,純度100%)、雌三醇(estriol,純度97.4%)、己酸羥孕酮(hydroxyprogesterone caproate,純度99.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院;甲烯雌醇醋酸酯(melengestrol acetate,純度99.5%)、醋酸羥孕酮(hydroxyprogesterone acetate,純度99%)、孕酮(progesterone,純度99%)、睪丸酮(testosterone,純度99%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;甲炔諾酮(norgestrel,純度99%)購自美國Sigma-Aldrich公司,14種性激素類藥物的化學結構式見圖1。用甲醇分別配制14種性激素類藥物的標準儲備液,于4 ℃冰箱冷藏保存;分別取標準儲備液適量,配制成質量濃度約為0.01～100 μg/L的混合標準工作液。

1.2 實驗條件

1.2.1樣品前處理

樣品為片劑,需先研成細粉;樣品為膠囊,需先取其內容物研成細粉.

稱取處理過的樣品1.0 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL離心管中,加入飽和氯化鈉溶液3 mL(液體樣品加入3 mL飽和氯化鈉溶液后,再加入0.5 g氯化鈉),渦旋5 min,加入3 mL乙腈,渦旋3 min,超聲提取20 min,于-18 ℃以8 000 r/min的轉速離心5 min,取乙腈層(上層);于下層中再加入3 mL乙腈,同法處理,合并兩次提取得到的乙腈層,于45 ℃水浴氮氣吹干,用3 mL甲醇-水(30∶70, v/v)溶解殘渣,待凈化。

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取柱,將處理好的樣品上樣后,依次用3 mL水、3 mL甲醇-水(40∶60, v/v)淋洗,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,于45 ℃水浴氮氣吹干,用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水(30∶70, v/v)溶液溶解并定容至1 mL,待測。

1.2.2色譜條件

色譜柱:Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A為10 mmol/L乙酸銨水溶液,B為乙腈;流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～5 min, 25%B; 5～18 min, 25%B～60%B; 18～22 min, 60%B; 22～24 min, 60%B～90%B; 24～29 min, 90%B; 29～32 min, 90%B～25%B; 32～39 min, 25%B。進樣體積:5 μL。

1.2.3質譜條件

電離方式:APCI;掃描模式:正離子/負離子;檢測方式:選擇反應監(jiān)測(SRM)模式;電暈電流:4 μA(正模式)、10 μA(負模式);鞘氣流速:4.87 L/min;輔助氣流速:3.41 L/min;反吹氣流速:1.5 L/min;離子傳輸管溫度:350 ℃;蒸發(fā)溫度:300 ℃。

14種性激素類藥物的保留時間及其他質譜參數(shù)見表1。

表 1 14種性激素類藥物的質譜參數(shù)

APCI: atmospheric pressure chemical ionization; * quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 離子源的選擇

液相色譜-質譜儀使用的離子源為大氣壓離子(API)源,根據(jù)離子化原理分為3種,電噴霧電離(ESI)源的原理是在流動相添加劑的幫助下,化合物在溶液中形成帶電離子,進入ESI源,在霧化氣和高溫蒸發(fā)作用下,帶電液滴逐步脫溶劑形成化合物的氣態(tài)離子,ESI源適用于極性化合物的分析,應用范圍最廣[13]; APCI源是在電暈放電作用下,霧化氣氮氣和氣化的流動相溶劑發(fā)生反應,生成預反應離子,預反應離子與溶劑分子反應生成反應離子H3O+和OH-,反應離子以質子轉移的方式與化合物分子反應,形成離子,這一過程均在氣相狀態(tài)中完成,所以要求化合物易揮發(fā),熱穩(wěn)定,適合中低極性化合物的分析[14];大氣壓光電離(APPI)源是利用紫外燈或激光的照射使氣相中帶有共軛雙鍵的化合物選擇性電離,適合弱極性和非極性化合物的分析[15]。在食品藥品等檢測領域,ESI源應用最為廣泛,其次為APCI源,其可作為ESI源的重要補充[14]。有研究[16]表明,相對APCI源,采用ESI源時的基質效應更為顯著。國內已有的性激素檢測類研究多采用ESI作為離子化方式[10-12],鮮少有APCI源用于性激素類藥物的檢測。

在對14種性激素類藥物結構進行分析時發(fā)現(xiàn),由于性激素類藥物多具有含有稠環(huán)的甾體母核結構,符合APCI源適合中低極性小分子化合物的分析特性。有文獻[17,18]報道,采用APCI源測定雌激素和脫氫表雄酮時的基質效應更小,離子化效率更高。本實驗取1.1節(jié)配制的混合標準工作液,分別用ESI源和APCI源進行分析,檢出限以3倍S/N計算。結果發(fā)現(xiàn),其中雌三醇、己烯雌酚、米非司酮在采用ESI源測定時的檢出限較低,甲烯雌醇醋酸酯在采用ESI源和APCI源測定時的檢出限相同,其余10種性激素類藥物在采用APCI源測定時的檢出限較低。分析化合物結構可知，米非司酮含有一個叔氨基,具有較強的親質子能力;雌三醇和己烯雌酚均含有酚羥基,具有較強的去質子能力,因此這三者采用ESI源測定時響應更好。而其他大多數(shù)性激素類藥物缺少類似的極性基團,在采用ESI源測定時響應較差。綜合考慮,選擇APCI源同時測定14種性激素類藥物。各待測化合物選擇反應監(jiān)測色譜圖見圖2。

圖 2 14種性激素類藥物的選擇反應監(jiān)測色譜圖Fig. 2 Selected reaction monitoring (SRM) chromatograms of the 14 sexual hormones

2.2 凈化條件的優(yōu)化

圖 3 不同體積分數(shù)的甲醇水溶液對14種性激素類藥物回收率的影響Fig. 3 Effect of different volume fractions of methanol aqueous solution on the recoveries of the 14 sexual hormones

圖 4 經(jīng)固相萃取柱凈化前、后空白加標樣品的全掃描色譜圖Fig. 4 Full scan chromatograms of the blanks spiked samples before and after purification with HLB SPE cartridges

由于保健食品多以動植物為原料,基質較為復雜,在采用液相色譜-質譜法分析時,可能污染離子源,或對化合物檢測產生干擾。因此需要對提取后的樣品進行凈化。有研究[10]采用酸性氧化鋁固相萃取柱和C18固相萃取柱依次凈化樣品,過程較復雜,重現(xiàn)性不佳。陳才軍等[11]比較了NH2固相萃取柱、氧化鋁固相萃取柱和HLB固相萃取柱在測定雌激素時的凈化效果,HLB固相萃取柱明顯優(yōu)于前二者;徐英江等[19]證實HLB固相萃取柱對大部分含雌激素樣品的凈化效果和回收率優(yōu)于硅藻土-硅膠(SLH)固相萃取柱和Carb-NH2(石墨化炭黑-氨基串聯(lián))固相萃取柱。HLB固相萃取柱的吸附劑為N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物,是一種親水親脂平衡的全能型反相吸附材料,其pH值適用范圍寬為0～14[20],對極性和弱極性化合物均可保留,并且具有水可潤濕性,柱床不容易干涸[21]。近年來HLB固相萃取柱越來越多的運用于食品[22,23]、保健食品[20,24]、農獸藥殘留[25,26]和環(huán)境監(jiān)測[27,28]的分析中。結合文獻[11,19],本實驗采用HLB固相萃取柱作為凈化柱,將混合標準溶液用水稀釋至適宜濃度,上樣,采用體積分數(shù)為10%～100%的系列甲醇水溶液分別洗脫,收集洗脫液,按1.2.1節(jié)方法進行處理,測定不同體積分數(shù)的甲醇作為洗脫液時性激素類藥物的回收率,結果見圖3。實驗表明,采用10%～40%(v/v)甲醇水溶液作為洗脫液時,14種性激素類藥物的回收率均為0,采用50%～100%(v/v)甲醇水溶液作為洗脫液時,14種性激素類藥物的回收率隨著甲醇體積分數(shù)的增大逐漸增大。因此,選擇40%(v/v)甲醇水溶液作為淋洗液,100%(v/v)甲醇水溶液作為洗脫液,可在不影響待測化合物回收率的前提下,最大程度的去除提取液中的極性雜質,凈化基質。

在空白樣品中加入混合標準溶液,按1.2.1節(jié)描述處理,分別取凈化前和凈化后的樣品殘渣,用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水(30∶70, v/v)溶液溶解并定容至1 mL,對其進行全掃描,得到總離子流色譜圖(見圖4)。可以看出,凈化后,保留時間在3 min之前的極性較強的部分雜質被去除,減少了對質譜的污染,且背景噪聲降低,待測化合物的信噪比增強。

2.3 方法學考察

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

取1.1節(jié)配制的混合標準工作液,以目標化合物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標,質量濃度(X, μg/L)為橫坐標,以1/x2為權重回歸標準曲線(見表2)。結果表明,14種性激素類藥物在各自的線性范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系,相關系數(shù)(r)均大于0.996。檢出限和定量限分別以3倍和10倍S/N計算,結果表明，檢出限為0.099 0～2.09 μg/kg,定量限為0.495～5.23 μg/kg(見表2)。

2.3.2回收率和精密度

在空白樣品中加入低、中、高3個水平的混合標準溶液,按1.2.1節(jié)樣品前處理方法,進行加標回收率的測定(n=6)。結果表明,保健食品中14種性激素類藥品的平均加標回收率為65.8%～118.8%, RSD均≤8.7%(見表3)。

2.3.3穩(wěn)定性

在空白樣品中加入混合標準溶液,按1.2.1節(jié)方法進行處理后,分別保存0、2、4、8、12和24 h,測定不同時間點14種性激素類藥物的含量(見圖5)。結果發(fā)現(xiàn),在24 h內,14種性激素類藥物的穩(wěn)定性良好,其含量變化小于7.8%。

表 2 14種性激素類藥物的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 保健食品中14種性激素類藥物的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

圖 5 24 h內14種性激素類藥物的含量Fig. 5 Contents of the 14 sexual hormones within 24 h

2.4 樣品測定

按照建立方法對不同渠道購買的不同品種多個批次保健食品(共計35批)進行分析。結果表明,2批樣品檢出睪酮11.7～21.0 μg/kg; 1批樣品檢出孕酮36.4 μg/kg,其余均未檢出。

3 結論

本實驗建立了超高效液相色譜-大氣壓化學電離-三重四極桿質譜(UPLC-APCI-MS/MS)測定保健食品中14種性激素類藥物的方法。方法靈敏度高,前處理較簡便,回收率良好,適合固體類保健食品和液體類保健食品中性激素類藥物的檢測,同時也為其他樣品中性激素類藥物檢測方法的建立提供參考。