基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的代謝組學技術(shù)用于麥盧卡蜂蜜的甄別

嚴麗娟, 徐敦明*, 薛曉鋒, 林立毅, 賴 康, 王建文, 張志剛

(1. 廈門海關(guān)檢驗檢疫技術(shù)中心, 福建 廈門 361026; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所, 北京 100093; 3. 四川省蜂業(yè)管理站, 四川 成都 610042)

麥盧卡蜂蜜采自名為麥盧卡(manuka)的天然紅茶樹,被譽為“新西蘭國寶”。麥盧卡蜂蜜具有上佳的抗菌活性,是世界上已經(jīng)批準的醫(yī)用級蜂蜜,主要用于促進傷口愈合、改善口腔及胃腸道健康等[1]。雖然麥盧卡蜂蜜價格昂貴,但因其神奇的功效,在市場上一直供不應求。早在2013年,麥盧卡蜂蜜的質(zhì)量問題就引起了廣泛關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計,麥盧卡蜂蜜的年產(chǎn)量只有1 700噸,但全球市場上以“麥盧卡”名義售出的新西蘭蜂蜜卻高達1萬噸。

麥盧卡蜂蜜的鑒定通常采用蜂蜜孢粉學分析法,輔以感官和理化分析,但是這種方法比較主觀,而且對技術(shù)水平的要求很高,有時會給出錯誤結(jié)果。蜂蜜的營養(yǎng)特性依賴于特定的化學成分,而這些成分隨蜜源的不同而不同。因此,基于蜂蜜物質(zhì)組成的鑒別方法具有很好的應用前景。

目前鑒別蜂蜜是否摻假的方法包括穩(wěn)定碳同位素比值分析法、薄層色譜法、高效陰離子交換色譜法、高效液相色譜法等[2,3]。食品的基質(zhì)非常復雜,傳統(tǒng)方法大多只檢測蜂蜜中數(shù)目有限的指標,無法對其真實屬性進行全面分析,因此亟須具有可預測性和非目標性的檢測技術(shù)對物質(zhì)組成、產(chǎn)地等真實屬性進行有效鑒定[4]。代謝組學基于全面分析小分子代謝物,結(jié)合多變量統(tǒng)計方法[5],可以對蜂蜜的代謝指紋譜進行綜合分析。核磁共振技術(shù)(NMR)在蜂蜜代謝組學中得到了較為廣泛的應用,例如NMR與模式識別方法聯(lián)用實現(xiàn)了阿根廷、匈牙利、意大利等國家13種蜂蜜的產(chǎn)地鑒別,并且成功區(qū)分了6種意大利單花蜜和雜花蜜[6-9]。

在代謝組學研究領(lǐng)域,液相色譜-質(zhì)譜法具有更高的靈敏度和分辨率,同時兼顧無偏向性,已經(jīng)逐漸成為代謝組學研究的主流技術(shù)[10]。國內(nèi)外研究者已經(jīng)將液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)用于單花蜂蜜和雜花蜂蜜,以及不同產(chǎn)地蜂蜜的鑒別[11-17],針對麥盧卡蜂蜜也發(fā)展了相應的靶向分析方法[14,15]。本研究采用基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的非靶向代謝組學技術(shù)對麥盧卡蜂蜜以及國內(nèi)主要蜂蜜品種(包括油菜蜜、槐花蜜、棗花蜜等)的代謝物進行全面分析,建立了模式識別模型,并篩選標志性代謝物,實現(xiàn)了對麥盧卡蜂蜜的真?zhèn)舞b別。該法對蜂蜜的質(zhì)量控制具有重大意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UltiMate 3000 UHPLC液相色譜儀、Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo公司); Allegra 64R型高速冷凍離心機(美國Beckman公司); 12通道半自動固相萃取裝置(美國Supelco公司);旋渦混合器(德國IKA公司);全自動氮吹濃縮儀(美國Capiler Life Sciences公司); Prime HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國Waters公司)。

甲醇和乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;甲酸(色譜純)購自美國Fluka公司;鹽酸(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水由Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

本研究聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所,共收集到來源可靠的212例樣本,包括20例麥盧卡蜂蜜、66例油菜蜜、51例槐花蜜、31例百花蜜、15例棗花蜜、11例柑橘蜜、9例荊條蜜和9例椴樹蜜。樣品均由專人采集,并由專業(yè)人士進行嚴格的品種鑒別。

1.2 蜂蜜樣品前處理

準確稱取2.0 g蜂蜜樣品,置于10 mL離心管中,加入0.01 mol/L HCl (pH=2),定容至10 mL,渦旋混合至完全溶解,以10 000 r/min高速離心10 min,吸取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至Prime HLB固相萃取柱,用3 mL水淋洗,再用3 mL甲醇洗脫,于40 ℃氮氣吹干,加入0.6 mL 0.1%(v/v)甲酸水-乙腈(7∶3, v/v)溶解后,過0.22 μm尼龍濾膜。

從每個樣品中取出等量部分進行混合,制備成質(zhì)控樣品(QC),用于監(jiān)控儀器的靈敏度和穩(wěn)定性,并用于后續(xù)的代謝組數(shù)據(jù)矯正。

1.3 代謝組學分析

對于提取得到的代謝物,采用Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀,在正離子和負離子兩種掃描模式下,獲得完整的代謝指紋圖譜。

1.3.1色譜條件

色譜柱:Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:50 ℃;流動相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 0%B～35%B; 2.0～18.0 min, 35%B～100%B; 18.0～21.0 min, 100%B; 21.0～21.2 min, 100%B～0%B; 21.2～24.0 min, 0%B。進樣體積:10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI)源;電壓為3.5 kV;質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1 000; 全譜掃描分辨率為17 500;數(shù)據(jù)采集模式為棒狀質(zhì)譜圖模式(centroid mode)。采用數(shù)據(jù)依賴采集方法(DDA)獲得代謝物的MS/MS信息,掃描范圍為m/z100～1 500;碰撞能量(CE)為25、35和45 eV。

序列分析采用樣品隨機進樣方式。實際樣品分析前連續(xù)5次進樣QC樣品,用于儀器平衡；每20個樣本插入1個QC樣品和溶劑空白樣品；測定隊列的最后再次重復測定3次QC樣品。

1.3.3數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采集后,利用Compounds Discoverer(CD)軟件進行處理:數(shù)據(jù)導入、峰提取、峰對齊、代謝物信息提取、代謝物結(jié)構(gòu)預測、數(shù)據(jù)庫搜索。具體參數(shù)設(shè)定:質(zhì)量偏差設(shè)定為5×10-6(5 ppm),峰對齊最大保留時間偏移設(shè)定為0.5 min,信號強度最大偏差為30%,信噪比(S/N)最大窗口為3,未知物測定保留時間窗口設(shè)定為0.2 min,代謝物組成預測信號強度窗口設(shè)定為0.1,代謝物組成預測最大質(zhì)量偏差30%,鑒定數(shù)據(jù)庫為mzCloud與ChemSpider數(shù)據(jù)庫。

利用R語言包對CD軟件導出的代謝數(shù)據(jù)表進行基于QC樣品的局部加權(quán)非參數(shù)回歸(LOESS)處理,從而矯正儀器長時間運行導致的保留時間漂移和信號衰減,刪除數(shù)據(jù)表中QC平行樣品RSD大于20%的特征峰。將處理后的數(shù)據(jù)表導入Simca-p軟件進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)等多變量統(tǒng)計分析。標志物導入Metaboanalyst在線平臺進行聚類和鑒別分析。采用多元線性回歸模型,利用R語言平臺,建立蜂蜜種類(Y)與代謝標志物(X)的線性回歸。其中,蜂蜜種類設(shè)定為分類變量(麥盧卡設(shè)定為1,其他品種設(shè)定為0),β值為解釋變量X對于因變量Y的偏回歸系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

食品代謝組學已經(jīng)廣泛應用于人參、食用油、葡萄酒、橄欖油和肉類等食品的品種鑒別和原產(chǎn)地區(qū)分。利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測代謝組成分并配合統(tǒng)計學方法進行分析,是一種非常有潛力的蜜源甄別方法。同一蜜源植物由于遺傳性有著整體的相似性,因此同一種類的單花蜜在成分上也具有相似性。蜜蜂采集花蜜后,通過自身的釀造,蜂蜜和花蜜只是在糖分組成上發(fā)生了變化,而其中的微量成分如來源于蜜源植物中的次生代謝物一般不會發(fā)生較大的變化,這為采用代謝組學技術(shù)鑒別蜂蜜的種類提供了可能。

2.1 蜂蜜樣品前處理條件的優(yōu)化

樣品前處理是代謝組學分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過查閱文獻,實驗采用了3種方法對樣品進行處理:(1)純水提取法[16]; (2)甲醇-水(1∶1, v/v)(含1%(v/v)甲酸)提取法[17]; (3)鹽酸溶液(pH=2)結(jié)合固相萃取法(1.3節(jié)方法)。蜂蜜中含有高含量的糖類物質(zhì),這類物質(zhì)在質(zhì)譜上無法檢出,而且會對色譜柱和質(zhì)譜儀造成一定污染。如圖1所示,固相萃取法不但能除掉糖類物質(zhì),而且經(jīng)過HLB固相萃取柱處理后,麥盧卡蜂蜜樣品在正、負離子模式下的色譜峰數(shù)目均顯著增加。因此,最終確定1.3節(jié)方法作為最優(yōu)前處理方法。

2.2 PCA和PLS-DA分析

將采用優(yōu)化方法得到的代謝物信息導入Simca-p數(shù)據(jù)分析軟件進行后續(xù)統(tǒng)計分析,以考察樣品的聚類情況。PCA分析表明,在正、負兩種掃描模式下,所有混合QC樣品的投影點聚類緊密,表明方法的重復性良好并且數(shù)據(jù)處理過程中未引入任何偏差。麥盧卡蜂蜜均能夠與國內(nèi)典型蜂蜜(油菜蜜、槐花蜜、棗花蜜、百花蜜、荊條蜜、椴樹蜜、柑橘蜜)實現(xiàn)很好的區(qū)分,說明兩者的代謝指紋圖譜存在顯著差異(見圖2)。

將208例蜂蜜作為訓練樣本(training samples)建立多變量分析模型。與無監(jiān)督的PCA模式不同,PLS-DA屬于有監(jiān)督模式,能夠更好地實現(xiàn)不同種類樣品的聚類分析。實驗利用PLS-DA建立麥盧卡蜂蜜的鑒別模型,并篩選標志代謝物。如圖3所示,x和y分別代表第一主成分(t[1])和第二主成分(t[2]),麥盧卡蜂蜜和其他蜂蜜聚類在各自所屬的區(qū)域,二者能夠得到完全區(qū)分,而且置換檢驗也證明了PLS-DA模型的有效性。在此基礎(chǔ)上,可以運用該模型判定測試樣品是否為麥盧卡蜂蜜,判定標準是根據(jù)樣本在模型投影圖的位置進行綜合評估。如果樣品投影在圖3的矩形區(qū)域內(nèi)即判定為麥盧卡蜂蜜,換而言之,麥盧卡蜂蜜的判別需要同時滿足兩個條件:1)正離子模式下,125

圖 1 采用不同前處理方法時麥盧卡蜂蜜的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of manuka honey using the different preparation methods Method 1: pure water extraction; method 2: methanol-water extraction; method 3: hydrochloric acid extraction followed by solid phase extraction cleanup.

圖 2 正離子和負離子掃描模式下蜂蜜樣品的PCA結(jié)果Fig. 2 Principal component analysis (PCA) results of the honey samples under positive and negative ionization modesQC: quality control.

圖 3 正離子和負離子模式下麥盧卡蜂蜜和非麥盧卡蜂蜜的PLS-DA投影圖Fig. 3 Partial least squares-discrimination analysis (PLS-DA) score plots of the manuka andnon-manuka samples under positive and negative ionization modes

2.3 代謝標志物

小分子代謝物在蜂蜜蜜種鑒定方面具有至關(guān)重要的作用。本研究根據(jù)PLS-DA模型的變量權(quán)重值(VIP)值大于1、組內(nèi)偏差較小且非參數(shù)檢驗p值小于0.001的原則獲得麥盧卡蜂蜜標志代謝物。mzCloud數(shù)據(jù)庫利用精確相對分子質(zhì)量以及MS/MS質(zhì)譜信息進行匹配檢索,對差異標志物的質(zhì)量誤差、同位素相似性和碎片離子進行評分。在正、負離子模式下,實驗一共篩選得到34個標志代謝物(見表1),利用mzCloud數(shù)據(jù)庫鑒定差異代謝物,MS和MS/MS信息必須完全匹配。實驗還利用商品化標準品對芹菜素、梔子甙元、異丹葉大黃素、高香草酸、反式肉桂酸、金雀異黃素6種標志物進行了結(jié)構(gòu)驗證。如圖4所示,麥盧卡蜂蜜中標志代謝物的含量顯著高于其他蜂蜜,這些代謝物則是麥盧卡蜂蜜生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ),而且同一類型代謝物之間存在很強的相關(guān)性。

以往的文獻[2]表明,麥盧卡蜂蜜主要活性成分是甲基乙二醛(MGO),其抗菌能力很強且活性穩(wěn)定。MGO在以電噴霧電離源為離子源的質(zhì)譜中響應不高,雖然實驗沒有檢測出MGO,但是篩選到一些與MGO生物合成和代謝緊密聯(lián)系的醛類標志物。不法商家經(jīng)常在普通蜂蜜中添加人工合成的MGO,以仿造麥盧卡蜂蜜,從而謀取暴利。因此,基于MGO含量的傳統(tǒng)方法無法對這種摻假行為進行準確判斷,但以MGO和醛類標志物組合為目標物進行判斷可以增加鑒定的準確度。2017年5月,新西蘭Hills實驗室發(fā)布了Manuka5檢測法,包括4種化學標志物(3-苯乳酸、4-羥基苯基乳酸、2′-甲氧基苯乙酮和2-甲氧基苯甲酸)和1種DNA標記物[18]。與單一標志物相比,多種標志物的聯(lián)合鑒定可極大地提高對麥盧卡蜂蜜的鑒別能力。為了應對Hills實驗室的新標準,不法商家除了添加MGO,還向普通蜂蜜中添加了上述化學標記物,因此必須采用高通量技術(shù)對樣品實現(xiàn)全組成信息掃描。

本研究所用的代謝組學方法可以對數(shù)千代謝物進行同時檢測,實現(xiàn)整體代謝指紋譜的差異鑒別。如表1所示,實驗篩選得到麥盧卡蜂蜜中重要標志物包含了Manuka5檢測法中的兩個標志物(3-苯乳酸和甲氧基苯乙酮),含量分別比其他蜂蜜中的高近10倍和2.7倍。除此以外,標志物列表中還包括32種其他代謝小分子。實驗還在麥盧卡蜂蜜中檢測到高含量的二氫麻醉椒苦素,這種代謝物是新西蘭特有植物卡瓦卡瓦樹的重要成分。因此推測,麥盧卡蜂蜜除了采自麥盧卡紅茶樹,還有部分采自卡瓦卡瓦樹。

麥盧卡蜂蜜中二氫查耳酮含量是其他蜂蜜的9.6倍,這種酮類物質(zhì)甜度高但能量值較低,具有降低膽固醇和甘油三酯的作用,適合于肥胖患者和糖尿病人食用。與其他蜂蜜相比,麥盧卡蜂蜜還含有高含量的黃酮和肉桂酸類活性物質(zhì),這些物質(zhì)對于健康十分有益。黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗菌、消炎等作用,已經(jīng)廣泛應用于止咳、祛痰、平喘以及腫瘤、心血管等疾病的預防和治療[19]。肉桂酸類化合物也被眾多研究證明具有抗氧化和抑菌活性[20]。因此推測,麥盧卡蜂蜜的優(yōu)異抗菌效果并不僅僅源于其活性物質(zhì)甲基乙二醛,高含量的黃酮和肉桂酸類物質(zhì)也在其中發(fā)揮著重要作用。另外,實驗發(fā)現(xiàn),麥盧卡蜂蜜代謝標志物列表中包含大量具有抗腫瘤活性的物質(zhì),比如芹菜素、黃豆黃素、刺芒柄花素、多花水仙堿等,表明麥盧卡蜂蜜具有在腫瘤預防方面的可能應用潛力。

表 1 麥盧卡蜂蜜的標志代謝物

FC: the ratio of manuka honey group to non-manuka honey group;pvalue:t-test adjusted by false discovery rate (FDR).

圖 4 (a)代謝組火山圖和(b)代謝標志物熱圖Fig. 4 (a) Volcano plot of metabolome and (b) heatmap of differential markersM1-M34 were the same as that in Table 1.

進一步分析了代謝物標志物的受試者工作特征曲線(ROC)。曲線下面積(AUC)表示標志物的判別能力,AUC值越接近1,表示判別能力越強。所篩選到的生物標志代謝物AUC值為0.8～1.0,而且絕大多數(shù)標志物的AUC值大于0.9,表明它們具有很強的判別能力。標志物組合模型能夠提供比單一標志物更強的判別能力。利用在線ROCCET(ROC Curve Explorer & Tester)軟件對標志物組合進行了ROC分析,排名前5位的標志物組合的AUC值達到了0.99,表示模型具有很高的準確性和靈敏度(見圖5)。進一步建立多元線性回歸模型,34個代謝物構(gòu)建的回歸方程校正后的回歸系數(shù)(r)為0.991 6,說明34個代謝物組合能夠很好地解釋蜂蜜種類的變化,其中9種標志物對蜂蜜種類鑒別的影響最為顯著,按照顯著性排名前5位的標志物分別是3-苯乳酸、羥基二氫查耳酮、豆蔻明、羥甲香豆素和3-甲氧基肉桂酸。

麥盧卡蜂蜜是蜜蜂采集麥盧卡紅茶樹花釀制而成的蜜,因此這些差異代謝物能夠反映麥盧卡紅茶樹與其他蜜源植物的代謝區(qū)別。采用Metaboanalyst軟件對這些重要標志物的生物通路進行深入分析,發(fā)現(xiàn)麥盧卡紅茶樹的黃酮和黃酮醇生物合成通路顯著增強,而這正是麥盧卡蜂蜜區(qū)別于其他蜂蜜的生物學基礎(chǔ)。

圖 5 代謝標志物的ROC分析Fig. 5 Receiver operating characteristic curve (ROC)analysis of the metabolic markers

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了蜂蜜樣品的前處理方法,并發(fā)展了基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的代謝組學方法,應用其對麥盧卡蜂蜜和其他主要國內(nèi)蜂蜜品種進行準確鑒別,建立偏最小二乘法判別模型,對測試樣品取得很好的鑒定效果。本研究建立的代謝組學方法為麥盧卡蜂蜜的質(zhì)量控制提供了新的思路。