黑骨藤對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠的保護(hù)作用*

王 恒，吉楊丹，王燕林，黨榮敏，余躍生，沈祥春

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻 558003；2.貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNJ)是臨床上的常見疾病，其發(fā)生與周圍神經(jīng)干或其分支受到外界直接或間接力量作用損傷有關(guān)，因具有病程長(zhǎng)、損害大、治療困難等特點(diǎn)[1]，受損后的神經(jīng)修復(fù)與再生過(guò)程復(fù)雜，目前西藥治療PNJ療效局限[2]。民族藥中含有的治療PNJ藥物，因其具有療效確切、不良反應(yīng)小、多靶點(diǎn)作用等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。黑骨藤為蘿藦科，杠柳屬植物黑龍骨的干燥根或全株，具有活絡(luò)、通經(jīng)、祛風(fēng)、解毒等藥效。苗族藥名為蛙莽塞，是貴州苗族地區(qū)民間廣泛用于閉合性軟組織損傷、風(fēng)濕與類風(fēng)濕等疾病的民族藥，有“萬(wàn)藤之王”之美譽(yù)[3]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤具有抗急性痛風(fēng)作用及修復(fù)線蟲因熱刺激引起的神經(jīng)損傷，對(duì)神經(jīng)疼痛治療和修復(fù)神經(jīng)損傷有一定療效[4-5]。因此本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)夾持損傷模型，檢測(cè)黑骨藤對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index，SFI)及大鼠血清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，探討黑骨藤對(duì)坐骨神經(jīng)損傷(sciatic nerve injury，SNI)的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠120只，雄性，體質(zhì)量280～320 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黔) 2012-0001。實(shí)驗(yàn)前置于室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度65%，光照周期12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.1.2主要儀器與設(shè)備 R-210型旋轉(zhuǎn)蒸器購(gòu)自瑞士BUCHI公司，電爐、電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海越進(jìn)醫(yī)療器械一廠，DZF-4型真空干燥箱購(gòu)自上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠，TDL-4ZB型臺(tái)式低速離心機(jī)購(gòu)自湖南星科科學(xué)儀器廠，DG530酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司，KJ-210A型振蕩器購(gòu)自姜堰康健醫(yī)療器具有限公司，TS-100型搖床購(gòu)自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，BS223型電子天平購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.1.3藥物與試劑 黑骨藤飲片購(gòu)于貴州同濟(jì)堂制藥有限公司(由貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為西南杠柳黑骨藤的全株)，70%乙醇提取，提取率1.45%。白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒批號(hào)為201611，均為武漢基因美生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1SNI模型建立及給藥 120只SD大鼠分為4組，分別為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、黑骨藤10 mg/kg組(C組)、黑骨藤20 mg/kg組(D組)，每組30只。B、C、D組大鼠均行SNI手術(shù)：10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定于手術(shù)板(俯臥位)。消毒右股后部皮膚，剪刀剪一縱行切口(約1 cm)，暴露并游離坐骨神經(jīng)。在脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分離處用止血鉗夾閉(30 s)，造成神經(jīng)擠壓傷。用11-0無(wú)損傷縫線，固定于神經(jīng)外膜作為標(biāo)記。此時(shí)大鼠小腿及足完全癱瘓，展爪反射完全消失，則示造模成功[6]。A組暴露并游離坐骨神經(jīng)但不夾閉，縫合皮膚。術(shù)后C、D組大鼠每天分別給予10、20 mg/kg黑骨藤乙醇提取物灌胃，A、B組均用等體積的生理鹽水灌胃，灌胃容積均為20 mL/kg。各組均在術(shù)后第7、14、28天取材，每次10只。4組大鼠均用適量青霉素粉劑置傷口內(nèi)預(yù)防感染。

1.2.2SFI測(cè)定[7]自制行走箱通道(長(zhǎng)42.00 cm、寬14.35 cm)，等長(zhǎng)、等寬白紙鋪于箱底，通道遠(yuǎn)端放一鼠籠。將大鼠雙后肢蘸取碳素墨水，置于行走箱入口，大鼠在爬行過(guò)程中，每側(cè)后肢各留下4～5個(gè)足印，選擇印跡清晰足印，分別測(cè)量正常足(normal,N)及傷側(cè)足(experiment,E)的3個(gè)指標(biāo)：(1)足印長(zhǎng)度(print length，PL)，足尖到足跟的最大距離；(2)足趾寬度(toe spread,TS)，第1趾到第5趾的距離；(3)中間足趾寬度(intermediary toe spread,IT)，第2趾到第4趾的距離，結(jié)果精確到0.10 mm。將上述數(shù)據(jù)代入Bain公式，測(cè)得SFI(SFI=0為正常，SFI=-100為完全損傷)。SFI計(jì)算公式如下：SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT-8.8]

1.2.3血清制備及指標(biāo)測(cè)量 股總動(dòng)脈取血，離心(3 000 r/min，10 min) 取血清，分裝，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA檢測(cè)IL-1、IL-6、TNF-α水平，均嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

1.2.4大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察 股總動(dòng)脈取血后解剖大鼠，取無(wú)損傷縫線標(biāo)記處遠(yuǎn)側(cè)端坐骨神經(jīng)(約0.60 cm)，4%甲醛溶液固定備用。常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)比較 A組：術(shù)后第7天神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)基本正常，大部分軸索大小形態(tài)正常排列規(guī)則，個(gè)別輕度腫脹；大部分髓鞘結(jié)構(gòu)清楚，個(gè)別輕度變性；施萬(wàn)細(xì)胞形態(tài)數(shù)量分布正常；神經(jīng)束膜個(gè)別炎細(xì)胞浸潤(rùn)。第14、28天神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)基本正常，軸索大小形態(tài)正常排列規(guī)則，髓鞘結(jié)構(gòu)清楚，施萬(wàn)細(xì)胞形態(tài)數(shù)量分布正常。B組：術(shù)后第7天神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，中度軸索腫脹，輕度髓鞘變性，施萬(wàn)細(xì)胞中度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。第14、28天神經(jīng)纖維重度排列紊亂，重度軸索腫脹及脫失，重度髓鞘變性及脫失，施萬(wàn)細(xì)胞重度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；且在第28天時(shí)有中度纖維組織增生。C、D組：術(shù)后第7天時(shí)神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，輕度軸索腫脹，輕度髓鞘變性，施萬(wàn)細(xì)胞輕度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。第14天時(shí)C、D組大鼠神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，C組大鼠中度軸索腫脹、中度髓鞘變性、施萬(wàn)細(xì)胞中度減少，D組大鼠輕度軸索腫脹、輕度髓鞘變性、施萬(wàn)細(xì)胞輕度減少，兩組神經(jīng)束膜均為輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。C組第28天時(shí)神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，輕度軸索腫脹及脫失，輕度髓鞘變性及脫失，施萬(wàn)細(xì)胞輕度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度纖維組織增生；D組第28天神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)基本正常，大部分軸索大小形態(tài)正常排列規(guī)則，個(gè)別輕度腫脹；大部分髓鞘結(jié)構(gòu)清楚，個(gè)別輕度變性；施萬(wàn)細(xì)胞形態(tài)數(shù)量分布正常；神經(jīng)束膜個(gè)別炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

圖1各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)的病理組織學(xué)檢查(HE，×200)

2.2各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)SFI比較 與A組比較，B組各時(shí)間點(diǎn)SFI明顯降低(P<0.01)，證實(shí)模型復(fù)制成功。C、D組SFI與同時(shí)間點(diǎn)B組比較升高，但術(shù)后7 d差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組術(shù)后28 d明顯升高(P<0.01)，D組術(shù)后14、28 d出現(xiàn)明顯增高(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠SFI比較

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較

2.3各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清IL-1水平比較 與A組比較，B組術(shù)后7、14、28 d血清IL-1水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組血清IL-1水平明顯降低(P<0.05)，C組血清IL-1水平有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清IL-6水平比較 與A組比較，B組術(shù)后7、14、28 d血清IL-6水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組大鼠血清IL-6水平明顯降低(P<0.05)，C組大鼠IL-6有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.5各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平比較 與A組比較，B組術(shù)后7、14、28 d血清TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組大鼠術(shù)后7、14、28 d血清TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)，C組除術(shù)后28 d血清TNF-α水平降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，術(shù)后7、14 d的血清TNF-α水平雖有所降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表2 各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清IL-1水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

表3 各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清IL-6水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

表4 各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

3 討 論

SFI是對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行量化評(píng)價(jià)的客觀指標(biāo)[8]。神經(jīng)損傷對(duì)SFI的影響繼發(fā)于踝關(guān)節(jié)跖屈，腳趾屈肌和足內(nèi)在因素的損傷，足跡的特征表現(xiàn)為大鼠印跡長(zhǎng)度增加，腳趾展開的減少以及中腳趾展開減少[9]。對(duì)SFI的分析已被證明是評(píng)估SNI和修復(fù)后功能的可靠、可重復(fù)、經(jīng)濟(jì)且能定量的方法，通過(guò)對(duì)SFI的測(cè)量，可以直接反映SNI后的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能[10]。本研究結(jié)果顯示，B組較A組SFI明顯降低(P<0.01)，證實(shí)了SNI模型建立成功，在本實(shí)驗(yàn)劑量下，使用黑骨藤乙醇提取物治療SNI模型大鼠，可使大鼠的SFI明顯增加，且對(duì)SFI的提高呈劑量及時(shí)間依賴性，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)劑量的黑骨藤乙醇提取物治療，可以改善SNI模型大鼠的坐骨神經(jīng)功能，對(duì)SNI模型大鼠神經(jīng)的功能修復(fù)有明顯的治療作用。

周圍神經(jīng)纖維斷裂后，會(huì)出現(xiàn)一系列復(fù)雜的病理變化，如斷端遠(yuǎn)側(cè)的軸突，很快發(fā)生華勒氏變性而崩解，近側(cè)端發(fā)生逆行性退變[11]，是神經(jīng)功能受損的病理基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中，坐骨神經(jīng)HE染色證實(shí)，在本實(shí)驗(yàn)時(shí)程內(nèi)黑骨藤乙醇提取物的治療，能夠明顯減輕神經(jīng)纖維的腫脹、減少神經(jīng)組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等，幫助神經(jīng)組織恢復(fù)正常的組織形態(tài)，且D組較C組效果明顯，術(shù)后28 d較術(shù)后7、14 d效果明顯，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)劑量和時(shí)程內(nèi)，黑骨藤乙醇提取物的治療可以改善受損坐骨神經(jīng)的形態(tài)學(xué)損傷，減輕炎性反應(yīng)程度，是本實(shí)驗(yàn)中SNI模型大鼠神經(jīng)功能改善的病理學(xué)基礎(chǔ)。

WNT蛋白家族在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，對(duì)神經(jīng)軸突再生等起重要調(diào)節(jié)作用的，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。激活WNT信號(hào)通路能夠刺激促炎因子TNF-α和IL-1的產(chǎn)生，加重神經(jīng)病理性疼痛的進(jìn)展[12]。PNJ后，傷害性刺激從外周傳入中樞，膠質(zhì)細(xì)胞上相關(guān)分子模式感知這些信息后，會(huì)引起膠質(zhì)細(xì)胞激活，并使炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)釋放促炎性細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，導(dǎo)致坐骨神經(jīng)發(fā)生炎性反應(yīng)[13-14]，神經(jīng)炎性反應(yīng)使傳遞痛覺(jué)的神經(jīng)元興奮，促進(jìn)中樞敏化形成，在行為上則表現(xiàn)為痛覺(jué)等現(xiàn)象[15]。神經(jīng)炎性反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的形成中起著關(guān)鍵作用，減輕神經(jīng)炎性可以減輕疼痛保護(hù)改善神經(jīng)損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與B組比較，C組在術(shù)后28 d TNF-α水平明顯降低，D組術(shù)后7 d IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。證實(shí)了黑骨藤乙醇提取物的治療可減輕SNI模型大鼠神經(jīng)炎癥從而減輕神經(jīng)疼痛，改善損傷的神經(jīng)功能。

傳統(tǒng)醫(yī)藥中，黑骨藤主要用于跌打損傷、風(fēng)濕等痛證。本研究以近年來(lái)免疫炎癥理論在PNJ中的應(yīng)用為前提，結(jié)合課題組前期研究工作，建立坐骨神經(jīng)鉗夾傷模型，證實(shí)黑骨藤對(duì)SNI有一定保護(hù)作用，并且其藥效與劑量、時(shí)間有關(guān)，其作用機(jī)制可能與抑制免疫炎癥因子分泌有關(guān)。