南寧市某醫(yī)院2014-2017年結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA突變監(jiān)測分析*

韋善求，麻秋英，羅順達，倪祖彥，文樂敏

(廣西壯族自治區(qū)南寧市第四人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.醫(yī)務(wù)部 530023)

耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)治愈率低、病死率高，是全球性的難題和挑戰(zhàn)。中國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]，耐藥率及廣泛耐藥率均高于全球平均水平。近年發(fā)現(xiàn)MDR-TB有直接傳播的證據(jù)，其中診斷延遲是重要的高危因素[2]。藥敏試驗是我國診斷結(jié)核菌耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，但時間長約2～3個月，是影響耐藥結(jié)核病療效和傳染源控制的重要因素。線性探針技術(shù)(lineprobe assay,LipA)通過檢測結(jié)核分枝桿菌(mycobacterrium tuberculosis,MTB)rpoB、katG和inhA突變預(yù)測利福平(rifampicin,RFP)和異煙肼(isoniazid,INH)耐藥，最快6 h內(nèi)完成檢測，特異度和靈敏度高，被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦應(yīng)用于MDR-TB診斷[3]，這項技術(shù)在我國得到了廣泛應(yīng)用[4]。2014年起本院采用LipA技術(shù)對部分MTB -DNA陽性標(biāo)本進行了rpoB、katG和inhA突變監(jiān)測，及時為患者提供了用藥指導(dǎo)，現(xiàn)將結(jié)果進行回顧分析，為本地區(qū)結(jié)核病耐藥防控政策制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源 隨機選取2014年1月至2017年12月在本院進行MTB-DNA檢測，結(jié)果陽性且定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)循環(huán)閾值(cycle threshold，CT)≤20的標(biāo)本，排除同一患者重復(fù)標(biāo)本。MTB-DNA陽性的判定符合《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[5]的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 MTB-DNA試劑盒購自中山達安基因公司，Geno Type MTBDRplus試劑盒購自德國Hain Lifesciences公司。

1.1.3主要儀器 實時熒光RCR擴增儀購自美國ABI公司，RCR擴增儀購自Biometra公司，TwinCubator?雜交儀購自德國Hain Lifesciences公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 用寬口螺旋蓋無菌培養(yǎng)瓶采集下呼吸道痰液、肺泡灌洗液或膿性分泌物1～3 mL送檢。

1.2.2MTB-DNA檢測 在標(biāo)本中加1～2倍體積4%氫氧化鈉溶液，渦旋振蕩30 s，靜置15 min，使標(biāo)本均勻化。取1 mL加入1.5 mL離心管，14 000 r/min離心5 min，棄上清液。沉淀加滅菌生理鹽水1 mL混勻，14 000 r/min離心5 min，棄上清液，再重復(fù)1次，陽性質(zhì)控品不需要均勻化，處理方法與標(biāo)本相同；取MTB陰性、臨界陽性質(zhì)控品8 000 r/min離心5 s，吸50 μL加入1.5 mL離心管中。在標(biāo)本管和各質(zhì)控品管中加50 μL DNA提取液，充分混勻，100 ℃恒溫處理10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 μL加入PCR反應(yīng)管，上機擴增。結(jié)果分析按照說明書要求執(zhí)行。

1.2.3rpoB、katG和inhA突變檢測 包括4個步驟：(1)DNA提取，選取MTB-DNA陽性且CT≤20的標(biāo)本，沉淀物處理方法與1.2.2相同，用100 μL水中重懸沉淀物，95 ℃干浴器上滅活20 min，超聲波水浴中超聲振蕩15 min，10 000 r/min離心5 min，上清液即DNA模板。(2)多重PCR擴增，準(zhǔn)備含有DNA聚合酶的擴增體系 45 μL，加5 μL DNA 模板上機擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 2 min，循環(huán)10次；95 ℃ 25 s，53 ℃ 40 s，70 ℃ 40 s，循環(huán)30次；70 ℃ 8 min。(3)雜交：擴增產(chǎn)物與Gene Type MTBDRplus試劑盒中的膜條進行雜交，按說明書操作。(4)結(jié)果判讀：試條上有27條反應(yīng)帶，質(zhì)控帶6條包括標(biāo)記物質(zhì)控CC、擴增質(zhì)控AC、確認(rèn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群TUB帶、rpoB及katG和inhA位點質(zhì)控帶；11條野生型探針帶(WT)，10條突變探針帶(MUT)，當(dāng)6條質(zhì)控帶均顯色表示結(jié)果有效，按以下規(guī)則判讀：某一基因區(qū)所有WT帶均顯色，而無MUT帶顯色，表示該基因區(qū)沒有發(fā)生可檢測的突變，試驗菌株對相應(yīng)藥物敏感；若某基因區(qū)至少有1條WT帶缺失或(和)MUT顯色，表示試驗菌株對相應(yīng)藥物耐藥；若某基因區(qū)所有WT均顯色，但同時MUT顯色，提示標(biāo)本中同時存在耐藥株和敏感株(異質(zhì)性耐藥)。

1.2.4耐藥判定 rpoB+katG 或(和)inhA突變判定為MDR、katG或inhA突變判定為耐INH，rpoB突變判定為耐RFP，無rpoB、katG和inhA突變判定為敏感，MDR是指對一種以上的抗結(jié)核藥物至少包括 RFP 和 INH 同時耐藥。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 檢出率、耐藥率及觀察指標(biāo)中各參數(shù)的構(gòu)成比采用百分率方法進行統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2.1LipA檢測結(jié)果 部分結(jié)果見圖1。10號條膜rpoBWT條帶全部顯色，MUT2B(+)，判定為RFP異質(zhì)性耐藥；11號條膜[katGWT(-)MUT1(+)]，判定為INH耐藥；12號條膜[rpoBWT2/3(-)katGWT(-)MUT1(+)]，14號條膜 [rpoBWT3/4/5(-)katGWT(-)MUT1(+)]，判定為MDR；5～9、13、16、18～22號標(biāo)本的WT帶均顯色，無MUT顯色，判定為敏感株；1～4、15、17號條膜TUB(-)，判為試驗失敗。

CK為空白對照；23號為37RV標(biāo)準(zhǔn)株；10號為rpoB WT(+)MUT2B(+)；11號為katGWT(-)MUT1(+)；12號為rpoBWT2/3(-)katGWT(-)MUT1(+)；14號為rpoBWT3/4/5(-)katGWT(-)MUT1(+)；5～9、13、16、18～22號均為rpoBWT(+)、katGWT(+)、inhAWT(+)及對應(yīng)的MUT(-)；1～4、15、17 號均為TUB(-)

圖1 線性探針檢測結(jié)果圖

a：包括H526 (R,P*,Q*,N,L,S,C)位點突變；b：罕見的突變，僅在理論上能被檢測到，在體外可能檢測不到這種突變；c:包括rpoBWT1、2、3、2/3、3/4、4/5、5/6、7/8 野生型探針缺失

2.2rpoB、katG及inhA突變及其主要位點頻率 對2 624份標(biāo)本進行LipA檢測，2 072份結(jié)果有效，菌株的主要突變類型及位點見表1。rpoB突變株中，突變頻率居前的3個位點是S531L位,占194株(63.40%)、H526Y或H526D位，分別占34株(11.11%)、其他H526位，占26株 (8.50%)；INH耐藥相關(guān)突變包括katG突變245株、inhA突變52株、katG和inhA均突變6株，其中katG 315位點突變251株(82.85%)。rpoB、katG及inhA突變率見表2。

表2 rpoB、katG及inhA突變率[n(%)]

2.3突變類型 WT包括各種基因最重要的耐藥區(qū)， MUT是常見突變位點。根據(jù)“WT是否缺失或(和)MUT出現(xiàn)”分4種類型(表3)，其中“MUT出現(xiàn)并對應(yīng)WT缺失”是熱點突變型，“僅MUT出現(xiàn)”或“MUT出現(xiàn)并WT缺失(非對應(yīng))”突變型是異質(zhì)耐藥型，本研究共檢測到35株異質(zhì)性耐藥菌，突變型中“MUT出現(xiàn)并對應(yīng)WT缺失”型占81.37%。

表3 rpoB、katG和inhA突變類型[n(%)]

2.4相關(guān)耐藥 根據(jù)基因突變與表型耐藥的關(guān)系，本組病例有410例耐藥，其中303例耐INH，306例耐RFP，199例MDR(表4)。在rpoB突變株中耐多藥株占65.03%(199/306)，從無rpoB、katG和inhA突變株中隨機抽查同期進行MTB培養(yǎng)和藥敏試驗的患者30例，藥敏試驗結(jié)果全部敏感。

表4 rpoB、KatG及inhA突變相關(guān)耐藥[n(%)]

3 討 論

結(jié)核菌耐藥的主要機制是因為基因突變導(dǎo)致藥物作用靶位改變。RFP耐藥與rpoB突變有關(guān)，其中編碼507～533氨基酸位點的81個堿基是其耐藥決定區(qū)，RFP耐藥株中超過95%是在此區(qū)域發(fā)生突變；MTB對異煙肼產(chǎn)生耐藥與katG、inhA、kasA、ndh等多個基因突變有關(guān)，約有34.6%～94.3%在katG315位點發(fā)生突變，2.9%～21.5%在inhA啟動子區(qū)域發(fā)生突變。LipA法就是通過檢測rpoB、katG和inhA突變快捷獲得MDR信息，目前已經(jīng)在臨床推廣應(yīng)用。

根據(jù)文獻資料，湖南[6]、四川[7]和云南[8]地區(qū)結(jié)核病患者rpoB的突變頻率分別為13.09%、28.85%、35.39%，katG的突變頻率分別為10.05%、21.19%、30.15%，inhA的突變頻率分別為1.55%、3.31%、21.76%，本研究結(jié)果與湖南地區(qū)一致，但低于云南和四川地區(qū)，顯示我國不同地域MTB耐藥基因突變頻率存在差異性。在耐藥性方面，本院MTB耐多藥率、INH及RFP耐藥率低于重慶肺科醫(yī)院(16.70%、33.20%、32.94%)[9]，高于浙江省疑似結(jié)核病患者(6.66%、13.24%、9.78%)[10]，也高于廣西2010～2011年抽樣調(diào)查的數(shù)據(jù)(6.28%、12.10%、8.28%)[11]，而與廣西某結(jié)核病治療醫(yī)院培養(yǎng)法檢測的結(jié)果相近(10.97%、17.43%、16.78%)[12]，表明結(jié)核病定點治療醫(yī)院就診者中難治、復(fù)治的患者相對較多，耐藥情況相對嚴(yán)重，同時間接說明LipA法用于一線抗結(jié)核藥物耐藥的快速篩查是可行的。本院2 072例結(jié)核病患者中有19.79%對一線抗結(jié)核藥物耐藥，對這些感染者如果按照經(jīng)驗性使用國家推薦的標(biāo)準(zhǔn)方案(2H-R-Z-E/4H-R或2H2-R2-Z2-E2/4H2-R2)治療，結(jié)果是無效或是效果不佳，因此對于涂片陽性或MTB-DNA陽性的患者早期進行基因型耐藥檢測十分必要，這對提高結(jié)核病治愈率和控制MDR-TB疫情將有很好促進作用。

本資料中，rpoB 531、katG315位點的突變頻率與浙江[10]、湖北[13]和北京[14]地區(qū)的報道基本一致；耐RFP株中耐多藥占65.03%，提示rpoB突變后進一步轉(zhuǎn)化為MDR的概率高，可以作為診斷MDR-TB的分子標(biāo)志。已知katG和inhA突變與不同耐藥水平相關(guān)，katG突變往往顯示高水平耐藥(>1 μg/mL)，inhA突變顯示低水平耐藥(<1 μg/mL)，本研究中katG突變占INH耐藥相關(guān)突變的82.84%，說明本地區(qū)MTB對INH主要呈現(xiàn)高水平耐藥。

異質(zhì)性耐藥是指在同一標(biāo)本中同時存在敏感菌和耐藥菌的現(xiàn)象，主要由于敏感和耐藥菌株共感染或敏感菌株部分亞群發(fā)生耐藥突變所致。LipA法檢測表現(xiàn)為，當(dāng)MTB中耐藥亞群比例高于其方法學(xué)靈敏度時，突變型和野生型基因序列可同時被檢出，但表型是否耐藥取決于突變與非突變基因序列的比例。本研究中35株表現(xiàn)為“MUT出現(xiàn)并無對應(yīng)WT缺失”，說明標(biāo)本中同時存在敏感株和耐藥株。因此，對于異質(zhì)性耐藥的患者需要進一步做藥敏試驗以觀察其表型耐藥情況，如果菌株暫時保持藥物敏感性時，需要持續(xù)關(guān)注其耐藥變化，以便指導(dǎo)及時調(diào)整治療。

結(jié)核菌耐藥除了基因突變機制外，還有藥物外排泵機制、外膜蛋白缺失或數(shù)量減少以及其他未知的機制等。LipA法僅檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群由 rpoB、katG和inhA 區(qū)突變引起的耐藥，由其他耐藥機制引起的耐藥則不能檢測。所以LipA法主要適用于MDR-TB快速篩查而不能取代藥敏試驗。