貴州非阻塞性無精癥與易感基因多態(tài)性的相關(guān)研究*

王嬋娟，何 燕，張 婷，單可人，禹文峰，官志忠，安 宇

(1.貴州醫(yī)科大學地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室,貴陽 550004;2.貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室,貴陽 550004;3.貴州省人民醫(yī)院中心實驗室,貴陽 550002)

臨床調(diào)查顯示世界范圍內(nèi)約有5%的夫婦受到不孕的困擾，其中有50%是由于男性不育而造成[1]，其中非阻塞性無精癥(non-obstructive azoospermia，NOA)是最常見的男性不育癥類型之一，其發(fā)病率在成年男性中高達1%，該病的發(fā)病機制并不十分清楚，目前尚無十分有效的防治手段，給家庭社會帶來的危害巨大[2]。越來越多的研究顯示遺傳因素如影響精子發(fā)育的基因與NOA相關(guān)[3-11]。近年來，對NOA全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究發(fā)現(xiàn)了一些潛在的易感基因位點，分別是位于1p13.30、1p36.32、12p12.10及20p13.00的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，它們分別對應了PRMT6、PEX10/MMEL1、SOX5和LOC100289473/SIRPA/SIRPG幾個相關(guān)基因[12]。目前這些位點與無精癥之間的相關(guān)性并不十分明確，本研究對貴州人群NOA患者及正常健康對照人群中上述易感基因的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點進行了多態(tài)性分析，得到其基因型頻率的分布狀況，并探討易感基因的SNP與NOA的關(guān)聯(lián)，以期為早期診斷和干預提供一定的依據(jù)和線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究在知情同意的原則下隨機抽取貴州省人民醫(yī)院臨床確診的NOA患者病例(疾病組)以及正常健康體檢人群(對照組)為研究對象，研究對象均為漢族人群，樣本總量319 例，其中對照組174例，年齡(48.3±12.9)歲，疾病組145例，年齡(46.5±20.2)歲。入選的疾病組人群平均不育年限(4.5±1.2)年，臨床檢查已排除精索靜脈曲張、生殖道梗阻、隱睪、附睪損傷等其他泌尿生殖系統(tǒng)疾患，且無特殊病史及家族史，經(jīng)精液檢查，均確診為NOA。研究對象組間年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 (1)試劑：人基因組rs12097821(G/T)、rs2477686(G/C)、rs10842262(G/C)及rs6080550(C/T)SNP位點TaqMan探針分型試劑盒[TaqMan?SNP Genotyping Assays，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司]。(2)儀器：DU 640蛋白質(zhì)核酸定量分析儀購自美國Beckman公司。ABI StepOne Plus反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取與定量 對研究人群全血采用酚/氯仿抽提法抽提基因組DNA，后TE(Tris和乙二胺四乙酸緩沖液)溶解，DU640核酸蛋白分析儀測定計算DNA的含量，同時檢測DNA樣品的純度，將每個標本稀釋成20 ng/μL的應用液。

1.3.2SNP位點的TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR分析 采用人基因組rs12097821(G/T)、rs2477686(G/C)、rs10842262(G/C)及rs6080550(C/T)SNP位點TaqMan探針分型試劑盒進行基因分型，PCR擴增體系為10.00 μL，含DNA模板1.50 μL、2×TaqMan Genotyping Master Mix 5.00 μL、40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 0.25 μL、ddH2O 3.25 μL。ABI StepOne Plus RT-PCR儀進行PCR擴增，每96孔板設(shè)置3個空白對照(NTC)，反應條件為：95 ℃預變性10 min；92 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。ABI StepOne Plus RT-PCR儀在上述PCR基礎(chǔ)上進行等位基因識別分析，兩個位點均設(shè)置FAM、VIC探針和樣品孔、3個NTC空白對照，運用StepOne Software v2.1軟件，讀取熒光信號，通過X、Y軸散點圖分析各樣本的基因型。根據(jù)StepOne Software v2.1軟件分析結(jié)果，對每種基因型隨機選取樣本進行測序驗證，每個基因型選取2～3個樣本，而對StepOne Software v2.1軟件未能直接分型的樣本，則直接測序。

1.4統(tǒng)計學處理 根據(jù)StepOne Software v2.1軟件分析和測序結(jié)果確定樣本的基因型，基因型頻率和等位基因頻率用直接計數(shù)法計算。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。組間基因型頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用SNPstats軟件對SNP位點進行連鎖不平衡分析，SHEsis軟件構(gòu)建SNP單倍型并統(tǒng)計其頻率分布。

2 結(jié) 果

2.1各個SNP位點基因型和等位基因頻率統(tǒng)計分析 在對照組人群中4個SNP位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.064、0.170、1.000、1.000)，見表1、2。在檢測的4個SNPs多態(tài)性位點中，rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)及rs6080550(C/T)基因型頻率分布在疾病組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。疾病組rs2477686多態(tài)性位點C等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)，疾病組rs12097821和rs6080550多態(tài)性位點的T等位基因頻率也分別顯著高于對照組(P<0.05)，而rs10842262位點基因型及等位基因頻率分布在疾病組與對照組中的分布差異無統(tǒng)計學意義。另一方面，基因型頻率結(jié)果顯示rs2477686(C/C)、rs12097821(T/T)及rs6080550(A/A)分別增加人群中的NOA患病風險，OR值分別為2.64、2.61及13.52，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 SNP位點基因型分布[n(%)]

續(xù)表1 SNP位點基因型分布[n(%)]

表2 SNP位點等位基因頻率分布[n(%)]

2.2連鎖不平衡分析與單倍型分析 由于rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)分別位于1號染色體短臂的3區(qū)6帶和1區(qū)3帶，故采用SNPstats軟件對疾病組與對照組的上述2個SNPs位點進行連鎖不平衡分析。結(jié)果顯示，疾病組與對照組各位點之間存在連鎖不平衡現(xiàn)象，且具有較強的連鎖程度(D′=0.052，D′>0.05)。應用SHEsis軟件對上述2個連鎖不平衡的SNP位點構(gòu)建單倍型并統(tǒng)計其在疾病組與對照組中的頻率分布。結(jié)果 rs2477686與rs12097821構(gòu)建的C-T單倍型頻率分布在疾病組及對照組中差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，OR值為2.972，95%CI(1.645～5.372)。見表4。

表3 4個SNP位點基因型頻率患病風險OR值[n(%)]

表4 1號染色體單倍型頻率分布分析

3 討 論

無精癥的原因復雜多樣，一般分為阻塞性無精癥(obstructive azoospermia，OA)和NOA。綜合各文獻報道結(jié)果，NOA患者占男性不育者6%～26%。NOA是特發(fā)性男性不育的重要原因之一，其發(fā)病機制到目前為止不十分清楚，除去睪丸缺乏生精細胞外，大多無精癥睪丸病理表現(xiàn)為生精停滯[13]?；诖?，臨床和科研人員投入大量的精力去研究無精癥患者中精子發(fā)生相關(guān)基因的是否異常，以期找到發(fā)病的原因，從而達到干預治療無精癥的目的[14]。盡管早期研究發(fā)現(xiàn)Y染色體的微缺失可以直接導致NOA，然而越來越多的臨床實踐表明Y染色體的微缺失只是原因之一，其他許多遺傳因素如影響精子發(fā)育的基因也與之相關(guān)[3-11]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)了許多與NOA相關(guān)聯(lián)的基因如SPO11、EIF5A2、NR5A1、ART3、ZNF230、COX1O、MTHFR等，但研究都存在樣本規(guī)模較小的問題，研究數(shù)據(jù)具有一定局限性，且所研究的基因與疾病的關(guān)聯(lián)程度判斷的主觀因素大，存在很大的片面性[15-16]。目前這些研究的不足之處可以采用全基因組關(guān)聯(lián)研究技術(shù)進行彌補。SNP作為人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，位于基因調(diào)控區(qū)和精氨酸編碼區(qū)可影響基因表達、引起蛋白結(jié)構(gòu)改變、造成個體差異，已成為多基因疾病關(guān)聯(lián)研究的熱點。在一項NOA全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中，通過GWAS分析揭示了4種全新的中國人群NOA易感基因位點，該研究收集了中國男性人群2 927例NOA患者和5 734例健康對照，并且從906703個SNP位點中篩選確定分別位于染色體1p13.30、1p36.32、12p12.10和20p13.00的4個SNP位點，上述位點在NOA和正常群體存在顯著性變異；該研究認為這些區(qū)域是導致NOA發(fā)生的遺傳易感因素，而在這些區(qū)域中PRMT6、PEX10/MMEL1、SOX5和LOC100289473等相關(guān)基因可能與NOA關(guān)聯(lián)最緊密[12]。但這些位點與無精癥之間的相關(guān)性還不是十分明確，各個位點間的關(guān)聯(lián)也不十分清晰。

本研究對貴州人群NOA與正常人群進行了上述相關(guān)的位點多態(tài)性研究，在檢測的4個SNPs多態(tài)性位點中，rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)及rs6080550(C/T)基因型頻率分布在貴州人群疾病組與對照組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。疾病組rs2477686多態(tài)性位點C等位基因顯著高于對照組(P<0.05)，疾病組rs12097821和rs6080550多態(tài)性位點的T等位基因和A等位基因也分別顯著高于對照組(P<0.05)，而rs10842262位點基因型及等位基因頻率分布在疾病組與對照組中的分布無統(tǒng)計學差異。研究結(jié)果提示rs2477686、rs12097821及rs6080550位點多態(tài)性與貴州人群NOA可能存在一定的相關(guān)性，攜帶rs2477686 C等位基因、rs12097821 T等位基因及rs6080550 T等位基因者可能使NOA發(fā)病風險增加。

另一方面，連鎖不平衡分析與單倍型分析結(jié)果顯示：rs2477686與rs12097821構(gòu)建的C-T單倍型頻率分布在疾病組及對照組中差異具有統(tǒng)計學意義，提示單倍型C-T具有增加NOA的發(fā)病風險。而其他的單倍型頻率組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示與疾病患病風險關(guān)聯(lián)性較小。

本研究提示rs2477686、rs12097821及rs6080550位點多態(tài)性與貴州人群NOA可能存在一定的相關(guān)性，攜帶rs2477686 C等位基因、rs12097821 T等位基因及rs6080550 T等位基因者可能使NOA發(fā)病風險增加。rs12097821位點與PRMT6基因有關(guān)，而LUO等[17]最近發(fā)現(xiàn)PRMT6 能夠被雄激素受體下調(diào)，并且調(diào)控生精細胞的遷移以及凋亡，從而推測出其能在精子發(fā)生過程中扮演者重要的角色。rs2477686與基因PEX10關(guān)聯(lián)，CHEN等[18]發(fā)現(xiàn)果蠅PEX2與PEX10在果蠅的雄性生育中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。rs6080550與基因SIRPA/SIRPG相關(guān)，LU等[19]發(fā)現(xiàn)SIRPA/SIRPG 的蛋白編碼區(qū)的突變與NOA有關(guān)。

綜上所述，上述這些3個SNP相關(guān)位點周圍存在著與NOA發(fā)病相關(guān)的基因，提示和NOA的發(fā)病密切相關(guān)，但是確切的關(guān)系和發(fā)病機制仍有待于進一步的研究，而且SNP位點附近是否存在其他新的基因或者表達調(diào)控元件都值得進一步探索。這些研究的結(jié)果將為早期診斷和干預提供一定的依據(jù)和線索，以期最終達到減少不孕不育、提高人口素質(zhì)的目標，具有重要的臨床意義和社會意義。