PKG、PKA及VASP在人結直腸癌組織中的表達及臨床意義*

陳 晨，金 旭，翁稚穎，朱煥利，鄭昌博，劉偉軍，代澤蘭，肖 創(chuàng)，楊之斌△，楊為民▲

(1.昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院暨云南省腫瘤醫(yī)院，昆明 650118)

發(fā)生在結腸和直腸的結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大常見惡性腫瘤[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預計，到2030年，CRC的預期發(fā)病者超過220萬新病例和110萬死亡[2]。在我國，CRC的發(fā)病率和病死率每年均保持上升趨勢，由高到低依次為東部地區(qū)、中部地區(qū)、西部地區(qū)，且男性高于女性，年長者高于年輕者[3-4]。CRC的一般治療手段包括手術切除、放射治療和化療[5]。另外，使用抗血管生成療法(如貝伐單抗)和表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)抑制劑(如西妥昔單抗)的靶向治療也只在特定患者中有一定治療作用[6-7]，但患者的生存率仍然不高，5年內約為60%[8]，因此，需要尋找新的治療方案。

cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動物細胞中，PKG有兩種亞型，即PKG-Ⅰ和PKG-Ⅱ。近年來的一些研究表明，PKG具有舒張血管，改善血管功能等作用[9-10]，但在抗腫瘤特別是抗結腸癌方面鮮為少見。cAMP依賴性蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase,PKA)與PKG同樣是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前對PKA的研究大多集中在大腦學習記憶方面，包括神經(jīng)退行性疾病阿爾茲海默癥和帕金森病等[11-12]，但關于結腸癌方面的報道卻較少。血管擴張刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)是一種調節(jié)細胞形狀和極性的肌動蛋白結合蛋白，是PKG與PKA的共同作用底物蛋白。PKG優(yōu)先磷酸化Ser239(p-VASP Ser239)處的VASP，而PKA則是優(yōu)先磷酸化Ser157(p-VASP Ser157)處的VASP。有報道指出，VASP蛋白的表達與癌癥患者的疾病進展呈正相關，并且強調了它在惡性腫瘤中的重要性[13]。因此作者推測，作為VASP的直接上游蛋白激酶，PKG與PKA的表達與活性的變化與CRC有關。

基于以上文獻報道，本研究通過檢測分析CRC組織中PKG、PKA、VASP及其磷酸化蛋白的表達情況，旨在為CRC患者尋找到新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年3-9月云南省腫瘤醫(yī)院結腸外科經(jīng)手術切除的20例患者的癌變組織及其癌旁正常組織。20例患者相關的臨床病例指標包括性別、年齡、腫瘤直徑大小、腫瘤分化程度、TNM分期以及腫瘤標志物癌胚抗原(CEA)及糖蛋白125(CA-125)的測定結果。所有組織標本在手術完成后30 min獲得，再放于液氮中保存。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 PKG-Ⅰ兔單抗 (貨號：#3248) 、PKG-Ⅱ兔單抗 (貨號：#3248)、PKA兔單抗 (貨號：3927S)以及GAPDH兔單抗(貨號：#2118)均購自美國Cellsignaling technology公司；VASP兔多抗(貨號：SC-1395)、p-VASP Ser239兔多抗(貨號：SC-23507)、p-VASP Ser157鼠單抗(貨號：SC-365563)、羊抗兔二抗(貨號：SC-2005)和羊抗鼠二抗(貨號：SC-2004)均購自美國Santa cruz 公司；二辛酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0012)購自上海碧云天生物技術有限公司；Western blot檢測所用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳儀和半干轉儀購自美國BIO-RAO公司。

1.2.2Western blot 分析 將標本從液氮中取出后，快速剪成小塊后在冰上進行勻漿。收集勻漿經(jīng)4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清液。以牛血清清蛋白為標準，用BCA法對蛋白進行濃度測定。上樣20 μg 蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，后予15 V，30 min半干轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下，用5%脫脂奶粉TBST緩沖液對膜進行封閉1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。PKG-Ⅰ、PKG-Ⅱ、PKA、VASP、 p-VASP Ser157和p-VASP Ser239各個抗體(1∶500～1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。如前所述洗膜后，將膜與辣根過氧化物酶標記的抗IgG抗體(1∶8 000～1∶10 000)室溫孵育1 h。洗膜，化學發(fā)光(ECL)試劑顯跡。同時用GAPDH抗體(1∶10 000)作為內參照。采用Scion Image圖像分析系統(tǒng)對Western blot圖像進行分析計算。每例標本每個蛋白重復3次。

2 結 果

2.1臨床病理指標的相關性分析 PKG-Ⅰ、PKG-Ⅱ、PKA、VASP、 p-VASP Ser157和p-VASP Ser239各蛋白經(jīng)Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)其在每例CRC標本中均有表達。這些蛋白的表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期及CEA和CA-125有一定的相關性，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2Western bolt檢測結果 Western blot結果顯示，CRC組織中的PKG-Ⅰ、PKG-Ⅱ、VASP、p-VASP Ser157和p-VASP Ser239蛋白表達水平均顯著低于癌旁正常組織(P<0.05)。然而，CRC組織中的PKA蛋白表達水平與癌旁正常組織相比并無明顯差異，見圖1。

表1 CRC組織中各蛋白因子與臨床病理指標的相關性(n=20)

1：癌旁正常組織；2：結直腸癌組織；a：P<0.05,b：P<0.01，與癌旁正常組織比較

圖1Westernblot檢測CRC組織與癌旁正常組織中PKG、PKA、VASP及其磷酸化蛋白表達

3 討 論

PKG是蛋白激酶AGC家族的成員，從兩個不同的基因轉錄為兩種亞型，即PKG-Ⅰ和PKG-Ⅱ。PKG-Ⅰ分布比較廣泛，在血管平滑肌細胞(VSMC)、神經(jīng)元、血小板、血管和腸平滑肌細胞分布較多，在心肌、血管內皮和大多數(shù)白細胞中表達較少。PKG-Ⅱ表達更多的分布于腦、腸和腎。在腸道中，PKG-Ⅱ參與囊性纖維化跨膜調節(jié)劑陰離子通道和氯通道的活化，引起氯化物和碳酸氫鹽的外排，然后使水流入腸腔，從而調節(jié)腸壁細胞內外的滲透壓[14]。PKA是A型激酶錨定蛋白家族成員，由催化亞基和抑制性調節(jié)亞基組成，其通過磷酸化底物蛋白或轉錄因子，以調節(jié)基因的轉錄翻譯。PKA參與多個信號轉導網(wǎng)絡以調節(jié)細胞的生長、代謝及增殖等過程[15]。VASP屬于接頭蛋白 Ena/VASP 家族，可將細胞骨架系統(tǒng)連接到信號轉導通路，并且它在細胞骨架組裝、成纖維細胞遷移、血小板活化和軸突導向中發(fā)揮重要作用[16]。VASP作為PKG與PKA的共同作用底物，其區(qū)別在于兩種激酶對其作用的磷酸化位點不同，分別為p-VASP Ser239與p-VASP Ser157，兩種磷酸化蛋白的表達水平分別可提示PKG與PKA的活化水平。在本研究中，作者通過檢測20例CRC患者病變癌組織與正常癌旁組織中的PKG-Ⅰ與PKG-Ⅱ的表達水平，發(fā)現(xiàn)CRC組織中的兩種蛋白顯著低于正常的癌旁組織；同時，CRC組織中反映PKG活性的p-VASP Ser239的表達水平也顯著降低。這一研究結果提示，PKG蛋白的表達及活性均與CRC密切相關。雖然CRC組織中PKA的表達水平與正常組織中的表達相比并沒有明顯差異，但反映PKA活性的p-VASP Ser157的表達明顯降低，這一結果提示，CRC雖對PKA蛋白表達無顯著影響，但對其活性卻有顯著影響。另外，CRC中的VASP的表達水平同樣明顯降低。

WALDKIRCH等[17]的研究結果發(fā)現(xiàn)PKG-Ⅰ在腫瘤組織高表達時可以抑制腫瘤細胞的侵襲，因此推測其可能具有一定的抗腫瘤作用。與正常細胞相比，許多腫瘤類型的PKG-Ⅰ表達降低，其中也包括從結腸切除標本中收集的腫瘤組織。有研究表明，PKGⅠ對人結腸癌細胞SW620的生長抑制是由于減少血管內皮生長因子導致血管生成嚴重缺乏。有研究人員提出其機制可能是PKG-Ⅰ參與的凋亡通路MEKK1/MEK4/ JNK通路有關[18]。雖然目前還少有PKG-Ⅱ對結腸癌發(fā)生發(fā)展作用方面的報道，但已經(jīng)有關于其他癌癥方面的報道。FALLAHIAN等[19]的研究結果顯示cGMP可以誘導乳腺癌細胞的凋亡，并提出這一作用時與PKG-Ⅱ有關。近年來，有研究顯示PKG-Ⅱ在胃癌組織中表達和活性均明顯降低，并且證實提高PKG-Ⅱ活性可明顯抑制胃癌細胞的生長，而這一作用可能與EGFR/MAPK/ERK通路和EGFR/MAPK/JNK通路相關。本研究結果顯示，PKG-Ⅰ與PKG-Ⅱ在CRC中的表達水平低于正常組織，并且反映其活性的磷酸化底物p-VASP Ser239的蛋白同樣在CRC組織中表達減少，表明PKG兩種亞型的表達及活性均被抑制，這一結果與上述WALDKIRCH等[17]的結果一致。

錢晶等[20]在研究CRC肝轉移中cAMP/PKA通路的作用時發(fā)現(xiàn)，給小鼠腹腔注射cAMP類似物8-溴-cAMP后，原發(fā)灶中的PKA有微弱減少，而VEGF、E-鈣粘蛋白及MMP2 的表達卻有顯著變化。TINSLEY等[21]研究表明增加cAMP以激活結腸腫瘤細胞中的PKA并不顯著促成細胞死亡。然而，LEIPHRAKPAM等[22]的研究結果發(fā)現(xiàn)，在FET和GEO結腸癌細胞實驗中轉化生長因子β(TGF-β)和胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)增加細胞凋亡的機制可能與PKA的激活有關。

PKG與PKA是分別依賴于細胞內cGMP與cAMP水平磷酸化特定蛋白的激酶，與其相關的經(jīng)典的信號通路分別為NO-cGMP-PKG與AC-cAMP-PKA。BABYKUTTY等[23]的研究顯示NO-cGMP-PKG通過激活ERK-1/2和AP-1促進MMP-2/9的表達，可以抑制結腸癌細胞遷移/侵襲。FRANCIS等[24]發(fā)現(xiàn)細胞內的磷酸二酯酶(PDE)的可同時降低胞內cGMP與cAMP水平，抑制PKG與PKA活性，并表明非甾體類抗炎藥可通過抑制PDE的活性可增加cGMP與cAMP水平從而激活PKG與PKA，但通過抑制Wnt/β-Catenin信號通路誘導結腸腫瘤細胞凋亡僅與PKG有關[25]。

VASP作為一種肌動蛋白結合蛋白，也是細胞骨架蛋白，它控制著癌細胞的形狀、極性和細胞分裂，遷移和侵襲的膜組織。有研究表明，VASP Ser磷酸化作為調節(jié)肌動蛋白聚合速率和細胞骨架依賴性細胞器的關鍵因子，調控著絲狀偽足、板狀偽足、侵襲偽足、粘著斑和細胞-細胞連接等肌動蛋白依賴的膜細胞器[26]。宋勝江等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，VASP在結直腸癌組織中的表達明顯高于相對應的癌旁正常組織，這一結果與本研究結果一致。ALI等[28]研究結果發(fā)現(xiàn)，分別抑制p-VASP Ser157和誘導p-VASP Ser239 VASP磷酸化可控制肌動蛋白細胞骨架組裝以及結腸癌細胞的存活和死亡行為，這一結果表明，VASP Ser磷酸化的失調可能是造成結腸癌永生和侵襲性細胞表型發(fā)育的潛在因素。在本研究中反映PKA活性的p-VASP Ser157在CRC組織中與p-VASP Ser239同時降低，與ALI等[28]研究相悖，推測可能與研究對象不同有關：ALI等[28]研究用的結腸癌細胞，細胞種類較為單一，而本研究中用的是結腸癌組織，可能其中也含有其他細胞種類；另外，由于臨床標本珍貴、難得，推測可能與本研究的樣本量偏少有關，在后續(xù)相關研究中，將考慮增大樣本量。

本文系統(tǒng)的研究了PKG兩種亞型、PKA、VASP以及反映PKG與PKA活性的兩種VASP Ser磷酸化蛋白的表達水平在CRC組織已經(jīng)正常癌旁組織中的表達，研究結果提示PKG兩種亞型的活性及表達與CRC發(fā)生發(fā)展密切相關。這一結果與目前的相關報道呈現(xiàn)一致性。目前，信號轉導研究揭示藥物開發(fā)的新治療靶點，這種前景正在改善；而本研究結果正是為臨床診斷治療CRC尋找到新的治療靶點提供了參考依據(jù)。