MALAT-1和HIF-1α在三陰型乳腺癌中表達(dá)及臨床意義*

唐 靜，賈昱嫻，農(nóng) 麗，覃芳卉，鐘武寧，譚愛花，劉 燕，王洪學(xué)，王 涵，謝偉敏，陸永奎，周文獻(xiàn)

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺及骨軟組織腫瘤內(nèi)科，南寧 530021)

乳腺癌是分子水平表達(dá)高度特異的一類疾病，其中一種分子亞型為三陰型乳腺癌(TNBC)。該類型乳腺癌雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體-2(HER-2)均為陰性，是療效和預(yù)后較差的乳腺癌亞型之一[1]。探尋其發(fā)病機(jī)制和潛在的生物治療靶點(diǎn)成為近年來的熱點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異在低氧條件下介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成的異二聚體，其中β亞基不受氧的調(diào)節(jié)和影響，而α亞基是缺氧誘導(dǎo)的,是調(diào)節(jié)活性的功能亞基。研究證實(shí),HIF-1α在腫瘤組織中大量表達(dá),不僅與腫瘤組織的血管生成、能量代謝、侵襲轉(zhuǎn)移、放療抵抗性相關(guān)，還與藥物耐藥性相關(guān)[2]。在缺氧條件下腫瘤組織中的HIF-1α上調(diào)使肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本-1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1)基因啟動(dòng)子甲基化，使其在增殖的腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)[3]。MALAT-1屬lncRNA家族重要成員之一，長度約8.7 kb，基因位于人染色體11q13.1，具有高度保守的核苷酸序列。以往文獻(xiàn)報(bào)道，MALAT-1在乳腺癌中異常表達(dá)，參與乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲及克隆增殖[4-5]。但目前有關(guān)兩者在TNBC的表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)相關(guān)性的研究報(bào)道較少。本研究檢測TNBC患者癌組織標(biāo)本及其對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中MALAT-1、HIF-1α mRNA的表達(dá)情況，且分析其與TNBC的臨床特征關(guān)系。本研究了解MALAT-1、HIF-1α在TNBC的發(fā)生、發(fā)展中的作用，希望為TNBC患者的個(gè)體化治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集 收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2013年1月至2014年6月33例患者手術(shù)切除的TNBC及癌旁組織標(biāo)本，患者均為女性，年齡31～69歲，隨訪至2016年6月。腫瘤臨床分期Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例。標(biāo)本保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1染色方法 采用免疫組織化學(xué)SP法。對33例TNBC癌組織及癌旁組織依次進(jìn)行低聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟，水化，抗原修復(fù)，血清封閉，然后進(jìn)行兔抗人HIF-1α多克隆抗體一抗4 ℃孵育過夜。取出標(biāo)本后按說明書加入二抗。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，沖洗反藍(lán)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.2.2結(jié)果判定 采用染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)相結(jié)合的判讀標(biāo)準(zhǔn)。采用雙盲法判定染色結(jié)果。HIF-1α陽性定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)無染色或輕微染色判為陰性。細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)有較強(qiáng)染色，且陽性細(xì)胞數(shù)比例大于或等于50%，或者細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)染色，且陽性細(xì)胞數(shù)比例大于或等于10%判讀為陽性。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成 使用美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)絡(luò)查詢到相應(yīng)基因的mRNA序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Premier5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)基因引物，并用OLIGO 7.0對引物的可行性進(jìn)行評(píng)估。內(nèi)參選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。所有引物選擇聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)純化級(jí)別，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：MALAT-1上游引物5′-TGC CCA TTC ACT GCC TCC T -3′，下游引物5′-TGC CGA CCT CAC GGA TTT T-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為93 bp。HIF-1α上游引物5′-TCC AAG CCC TCC AAG TAT-3′；下游引物5′-ATG CTA AAT CGG AGG GTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為568 bp。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 Trizol法提取總RNA，操作按說明書進(jìn)行，采用ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(TaKaRa公司產(chǎn)品)：2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、500 ng總RNA、加入10 μL RNase Free ddH2O。然后在PCR儀42 ℃水浴2 min。按順序加入1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ、1.0 μL RT Primer Mix、4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2、4.0 μL RNase Free ddH2O、總體積20 μL。37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。水浴1～2 min。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA在-80 ℃中保存用于PCR。PCR總反應(yīng)體積為20 μL，包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，QNRox Reference Dye 0.2 μL，上下游引物各2 μL，CDNA模版2 μL，RNase-Free水6.8 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共循環(huán)40次。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，并采用自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀及分子分析軟件進(jìn)行圖像掃描和分析。將目的基因的mRNA實(shí)際表達(dá)水平與GAPDH mRNA實(shí)際表達(dá)水平比較，用2-△△CT法得到MALAT-1、HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1HIF-1α蛋白在癌組織及癌旁組織陽性表達(dá)情況 在33例TNBC組織中，有23例陽性表達(dá)HIF-1α蛋白,10例陰性表達(dá)HIF-1α蛋白；33例癌旁組織中，有15例陽性表達(dá)HIF-1α蛋白，18例陰性表達(dá)HIF-1α蛋白，TNBC組織的HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率(69.7%)明顯高于癌旁組織(45.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.97,P<0.05)。

2.2MALAT-1、HIF-1α在癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況 TNBC組織的MALAT-1的RNA表達(dá)水平為2.62±0.23，癌旁組織的表達(dá)水平為2.02±0.08，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.73，P<0.05)。TNBC組織的HIF-1α的RNA表達(dá)水平為129.79±15.34，癌旁組織的表達(dá)水平為43.46±5.14，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.48，P<0.05)。

表1 乳腺癌組織中的MALAT-1、HIF-1α的RNA表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)

2.3TNBC組織中的MALAT-1、HIF-1α的RNA表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 33例TNBC患者有5例分化程度Ⅰ級(jí)，16例Ⅱ級(jí)，12例Ⅲ級(jí)；15例沒性有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，18例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性；浸潤深度Tis～T1有10例，T2有14例，T3～T4有9例；臨床分期Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例。隨訪期間出現(xiàn)復(fù)發(fā)14例，沒有出現(xiàn)復(fù)發(fā)19例。癌組織中的MALAT-1、HIF-1α mRNA的表達(dá)水平與TNBC的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

3 討 論

由于TNBC作為乳腺癌的一種分子亞型，其復(fù)發(fā)率高，耐藥性及易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)是該疾病預(yù)后差的主要因素，目前臨床上尚無對于TNBC有效的治療措施。TNBC腫瘤生長微環(huán)境的機(jī)制尚不清楚。如何選擇靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療成為TNBC治療的關(guān)鍵和難點(diǎn)。缺氧微環(huán)境常見于快速生長的腫瘤組織中。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤新生血管無法滿足無限增殖的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞氧濃度下降，脯氨酸羥化酶、天冬酰氨胺羥化酶失活，進(jìn)而激活下游靶基因HIF-1α轉(zhuǎn)錄。HIF-1α通過與低氧反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以激活多種靶基因產(chǎn)物，并且大多數(shù)靶基因在腫瘤組織的血管生成、能量代謝、侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[7]。

MALAT-1是第一個(gè)被證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)的lncRNA，其高表達(dá)與早期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。研究表明MALAT-1 lncRNA在MCF-7乳腺癌細(xì)胞缺氧條件下高度表達(dá)[9]。研究證實(shí)MALAT-1在多種腫瘤組織出現(xiàn)異常表達(dá)，可能參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、遷移及侵襲等過程[10-12]。

本研究結(jié)果表明，HIF-1α蛋白、MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC癌組織的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示MALAT-1、HIF-1α RNA的異常表達(dá)可能參與了TNBC的發(fā)生、發(fā)展過程，與近年來相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-18]。提示乳腺癌組織中HIF-1α蛋白、MALAT-1、HIF-1α RNA的表達(dá)可作為其向惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

本研究顯示 MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC的表達(dá)與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān),提示MALAT-1、HIF-1α可能在TNBC發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了一定的作用,并有可能提示預(yù)后，與近年來相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[19-22]。文獻(xiàn)報(bào)道，已有基于HIF-1的靶向治療處于試驗(yàn)階段，利用 HIF-1為靶點(diǎn)的基因治療主要有反義核酸技術(shù)和RNA干擾。其中代表藥物有miR-20b、EZN-2968，均可以抑制腫瘤HIF-1α的表達(dá)，將在未來進(jìn)入臨床階段[23]，有望為TNBC找到新的有效的靶向治療途徑。本研究顯示,MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC中的表達(dá)與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期具有相關(guān)性。

本研究尚有許多不足之處,比如樣本量較小,有一定的局限性,MALAT-1和HIF-1α的作用機(jī)制缺乏分子水平實(shí)驗(yàn)支持,有待在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步補(bǔ)充。