應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定死活結(jié)核分枝桿菌的實驗研究

王偉亮，謝 貝，孟繁榮，王 楠，楊 瑜，劉志輝，譚守勇，張言斌

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州511436；廣州市胸科醫(yī)院2.結(jié)核內(nèi)科，3.肺部疾病研究所，廣東廣州510095）

據(jù)WHO估計，2017年全球有約1 000萬例結(jié)核病患者，其中利福平耐病例約56萬、耐多藥結(jié)核病例約46萬，結(jié)核病為目前單因致死率最高的十大感染性疾病之一（其于HIV/AIDS），是全球的重大公共衛(wèi)生問題［1］。利福平耐藥病例和耐多藥結(jié)核病例的流行與蔓延［2］對實現(xiàn)WHO提出的2035年全球終結(jié)結(jié)核病的宏偉目標(biāo)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［3］。挑戰(zhàn)主要來自兩個方面：一是沒有較為理想的早期診斷方法［4］，二是沒有較多可供選擇的抗結(jié)核新藥［5］。就早期診斷而言，目前主要依據(jù)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗和耐藥基因分子檢測［4，6］：前者耗時長，平均約需2個月；后者雖然快速，但技術(shù)要求較高、檢測費(fèi)用昂貴，且存在檢測的準(zhǔn)確性問題。另外，在同一樣本中同時存在耐藥菌與敏感菌的結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥更使結(jié)核分枝桿菌耐藥性的準(zhǔn)確鑒定困難加?。?］，高旭等［8］應(yīng)用用基因測序和熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的相關(guān)研究顯示，它們不能指示耐藥菌比例低于20%的混合菌液。我們設(shè)想，若有一種方法能定量指示樣本中的耐藥菌與敏感菌，結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性和異質(zhì)性耐藥的測定則可同時得到解決。此前，人們就對流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）在此類問題中的應(yīng)用進(jìn)行了諸多探索［9-10］，并已取得了全面的進(jìn)步與輝煌的成就［11］，其間也偶有利用FCM進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性測定的實驗研究報道［12］。判斷細(xì)菌對某種抗生素是否耐藥的核心標(biāo)志是一定條件下接觸藥物后能否存活，若人們可以找到能良好標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌活菌與死菌的熒光染料，而FCM能進(jìn)行單細(xì)胞計數(shù)分析，兩者相結(jié)合則可對樣本中的死、活菌（亦即敏感菌和耐藥菌）進(jìn)行定量分析。前期研究中，我們探討了6-羧基二乙酰熒光素（6-Carboxyfluorescein diacetae，6-cFDA）、熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetae，F(xiàn)DA）、碘化丙錠（Propidium Iodide，PI）和SYTO9等染料對結(jié)核分枝桿菌的染色性能［13］，本研究在此基礎(chǔ)上選擇了PI和6-cFDA兩種染料用于死、活結(jié)核分枝桿菌的鑒定，并對其鑒定能力進(jìn)行了系統(tǒng)的確證性實驗研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

在本院結(jié)核病生物樣本庫中隨機(jī)抽取-80℃凍存結(jié)核分枝桿菌臨床分離株60株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)；選擇復(fù)蘇培養(yǎng)生長良好的20株隨機(jī)均分兩組，按后續(xù)實驗需求進(jìn)行增菌培養(yǎng)。另外，從凍存庫中取出結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)與增菌培養(yǎng)，用于FCM分析方法建立，實驗操作與臨床分離株相同，具體操作見實驗方法。研究所用結(jié)核分枝桿菌活菌菌液為新鮮培養(yǎng)且生長良好的對數(shù)期鮮活菌液；死菌菌液制備依據(jù)參考文獻(xiàn)［14］將1麥?zhǔn)蠞岫然罹航?jīng)85℃加熱30 min處理而得，并經(jīng)Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)8周證實無細(xì)菌生長。實驗工作經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀FACSAriaTMⅡ為美國BD公司生產(chǎn)，細(xì)菌超聲分散儀BACspreaderTM 1100為廣東體必康生物科技有限公司生產(chǎn)；300目不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)購自翔博生物科技有限公司，Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基和Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基購自美國BD公司，PI購自美國LIFE公司，6-cFDA購自美國SIGMA公司，PBS（pH 7.4±0.1）購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復(fù)蘇培養(yǎng) 考慮到-80℃凍存菌株僅約60%的復(fù)蘇成功率，在生物樣本庫中應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)挑選3倍于研究樣本量的60株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。主要實驗步驟包括：取出凍存菌株37℃恒溫箱放置約24 h，取約0.3 mL凍存菌株混懸液接種于Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基斜面，置37℃恒溫箱培養(yǎng)4周。

1.3.2 增菌培養(yǎng) 在60株復(fù)蘇培養(yǎng)樣本中挑選生長良好菌株20株，隨機(jī)分為兩組，一組用于平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）界值確定試驗，一組用于性能檢測試驗。主要實驗步驟包括：在復(fù)蘇培養(yǎng)管中挑取菌落置于約4 mL Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中，應(yīng)用細(xì)菌超聲分散儀制作1麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌混懸液，取約0.3 mL混懸液接種于Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基斜面，每一菌株接種2～3管，置37℃恒溫箱培養(yǎng)4周。

1.3.3 PI、6-cFDA熒光染料貯存液配制 PI為1 mg/mL成品溶液，無須配制，置4℃冰箱避光保存。6-cFDA貯存液配制：稱取6-cFDA 9.2 mg，加入20 mL二甲基亞砜（DMSO）溶解，待粉末徹底溶解后用孔徑為0.25 μm的一次性針頭式濾器過濾，配制成1 mmol/L的6-cFDA溶液，分裝至EP管中（約130 μL/支）-20℃冰箱避光保存。

1.3.4 FCM分析菌液樣本制備 取增菌培養(yǎng)生長良好的標(biāo)準(zhǔn)菌株、MFI界值確定試驗菌株和性能檢測試驗菌株菌落，用無菌玻璃棒蘸取無菌生理鹽水將菌研磨成菌液勻漿，加入適量無菌生理鹽水混勻，再用細(xì)菌超聲分散儀分散，經(jīng)300目不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)濾過后，用無菌生理鹽水配制2管（2 mL/管）1麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌混懸液，并將其中1管放至恒溫水浴箱中85℃加熱30 min。加熱者即為死菌分析懸液，未加熱者則為活菌分析懸液。另外，對死菌分析懸液加做Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)實驗，實驗方法同上述增菌培養(yǎng)。

1.3.5 分析菌液PI與6-cFDA染色 臨用前，取出PI、6-cFDA貯存液，在避光情況下解凍并應(yīng)用PBS分別進(jìn)行200、50倍稀釋配制PI（5 μg/mL）和6-cFDA（20 μmol/L）工作液；在樣品管中加入300 μL分析菌液，再向其中加入300 μL PI或6-cFDA工作液，充分震蕩混勻，37℃恒溫孵育30 min，即為流式細(xì)胞儀檢測分析液。

1.3.6 流式細(xì)胞儀分析方法的建立與目的樣本檢測分析 首先，用熒光微球校準(zhǔn)儀器的光路和液流系統(tǒng)，保證儀器各項指標(biāo)在允許范圍。其次，以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv檢測分析液建立FCM分析方法，F(xiàn)CM分析方法建立的主要原則如下：以生理鹽水管和活菌管設(shè)前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）的信號值為對數(shù)放大，根據(jù)FSC/SSC的信號情況調(diào)節(jié)電壓；根據(jù) FSC（log）、SSC（log）、FITC（log）、PE（log）等參數(shù)，找到細(xì)菌最集中的區(qū)域設(shè)門，同時建立直方圖以計算PE、FITC通道上MFI，活菌管和死菌管互為對照。最后，依據(jù)建立的FCM分析方法分析目的樣本。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布計量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布計量結(jié)果用中位數(shù)表示，正態(tài)性檢驗應(yīng)用Shapiro-Wilk方法；活菌組與死菌組組間比較采用兩個獨立樣本的t檢驗（正態(tài)分布時）或兩個獨立樣本的秩和檢驗（非正態(tài)分布時），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；利用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）確定 MFI界值；性能檢測中的準(zhǔn)確度描述采用分類變量計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。準(zhǔn)確度=（真陽性個數(shù)+真陰性個數(shù)）/總數(shù)，靈敏度=真陽性個數(shù)/（真陽性個數(shù)+假陰性個數(shù)），特異度=真陰性個數(shù)/（真陰性個數(shù)+假陽性個數(shù)），Youden指數(shù)=靈敏度+特異度-1，陽性預(yù)測值=真陽性個數(shù)/（真陽性個數(shù)+假陽性個數(shù)），陰性預(yù)測值=真陰性個數(shù)/（真陰性個數(shù)+假陰性個數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 FCM分析方法的建立

以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv建立FCM分析方法：應(yīng)用活菌FCM分析菌液設(shè)門如圖1A；應(yīng)用無菌生理鹽水空白對照進(jìn)行檢測，其FSC/SSC二維散點圖見圖1B；應(yīng)用死、活菌PI染色后的分析菌液進(jìn)行FCM分析得PE通道的直方圖1C和D；應(yīng)用死、活菌6-cFDA染色后的分析菌液進(jìn)行FCM分析得FITC通道的直方圖1E和F。圖1B表明設(shè)門適當(dāng)，圖1C、D表明PI染色能準(zhǔn)確鑒定H37Rv死菌，圖1E、F表明6-cFDA染色能準(zhǔn)確鑒定H37Rv活菌。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv死、活菌經(jīng)PI或6-cFDA染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.1 Flow Cytometry Results of Dead or Living H37Rv Stained with PI or 6-cFDA

表1 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株P(guān)I或6-cFDA染色的MFI檢測Table 1 Detection of MFI of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis after staining with PI or 6-cFDA

2.2 PI和6-cFDA染色鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的MFI界值確定

2.2.1 PI和6-cFDA染色樣本MFI測定情況 10株死、活結(jié)核分枝桿菌PI染色的MFI值分別在1 886～5 967和219～772之間，死菌MFI值呈非正態(tài)性分布（P=0.014）、活菌MFI值呈正態(tài)分布（P=0.383）；10株死、活結(jié)核分枝桿菌經(jīng)6-cFDA染色的MFI值分別在43～56和1 986～13 530之間，均呈正態(tài)性分布（表1）。

2.2.2 死、活結(jié)核分枝桿菌PI和6-cFDA染色樣本間MFI的比較 對于PI染色，死菌MFI值呈非正態(tài)性分布、活菌MFI值呈正態(tài)分布，經(jīng)兩個獨立樣本的秩和檢驗Mann-Whitney U=0.00；Wilcoxon W=55.00；Z=-3.78，雙側(cè)檢驗P=0.000，活、死菌之間PI染色后的MFI差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對于6-cFDA染色，死、活菌MFI值均呈正態(tài)分布，兩樣本所屬總體方差不齊（F=25.635，P=0.000），經(jīng)t′檢驗，t=4.973，P=0.001，活、死菌之間6-cFDA染色后的MFI差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.3 PI和6-cFDA染色鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的ROC曲線與MFI界值 依據(jù)MFI測定值分別繪制應(yīng)用PI和6-cFDA染色鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的ROC曲線，如圖2A和B。由圖可見兩者ROC曲線下的面積均為1.000，標(biāo)準(zhǔn)誤差均為0.000，其95%的近似參考置信區(qū)間均為（1.000，1.000），說明兩種染色方法用于鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確度均較高。綜合靈敏度和特異度，PI染色鑒定死菌和6-cFDA染色鑒定活菌的MFI檢測界值分別為1 329和1 021，此時兩種染料鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的靈敏度均為1、特異度均為1。即當(dāng)結(jié)核分枝桿菌菌液經(jīng)PI染色后的MFI值大于1 329時，認(rèn)為該菌液為死菌；當(dāng)結(jié)核分枝桿菌菌液經(jīng)6-cFDA染色后的MFI值小于1 021時，認(rèn)為該菌液為活菌。綜上，PI染色可以明確鑒定死結(jié)核分枝桿菌、6-cFDA染色能夠明確鑒定活結(jié)核分枝桿菌。

表2 PI或6-cFDA染色鑒定結(jié)核分枝桿菌臨床分離株死和活Table 2 Identification of dead or living status of clinical isolates Mycobacterium tuberculosis by PI or 6-cFDA staining

2.3 應(yīng)用MFI界值鑒定死和活結(jié)核分枝桿菌

應(yīng)用不同于MFI界值確定的10株死、活結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行測試，經(jīng)PI染色10株死菌全部鑒定為死菌、10株活菌中有1株鑒定為死菌（其MFIPI為1 342，MFI6-cFDA為12 867），準(zhǔn)確度為95%；經(jīng)6-cFDA染色10株活菌全部鑒定為活菌、10株死菌全部鑒定為死菌，準(zhǔn)確度為100%（表2），并對兩種染料的鑒定性能進(jìn)行評估（表3）。

圖2 PI染色鑒定死菌（A）和6-cFDA染色鑒定活菌（B）MFI的ROC曲線分析Fig.2 Analysis of ROC curves of PI staining MFI for dead bacteria detection（A）and 6-cFDA staining MFI for living bacteria detection（B）

3 討論

對于細(xì)菌的活力迄今尚無直接測量指標(biāo)，目前人們一般應(yīng)用核酸染色、細(xì)胞膜功能試驗、氧化還原反應(yīng)和特定基因報告系統(tǒng)等間接評估細(xì)菌活力。PI作為一種非膜通透性染料，可以被完整的原核和真核細(xì)胞膜排斥于細(xì)胞膜外，只有當(dāng)細(xì)菌活力嚴(yán)重降低或其它原因而致細(xì)胞膜完整性遭到破壞時，PI方能進(jìn)入細(xì)胞以其菲啶環(huán)與細(xì)菌核酸結(jié)合并具增強(qiáng)熒光作用，因此PI染色著色即可顯示細(xì)菌已無活力；6-cFDA則是膜通透性染料，經(jīng)孵化后進(jìn)入活性細(xì)胞被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解形成不能透過細(xì)胞膜的6-羧基熒光素而使細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生熒光，死細(xì)胞則因缺乏活性酯酶而不能有效水解6-cFDA產(chǎn)生熒光［15］。我們的研究結(jié)果表明PI染色能準(zhǔn)確鑒定加熱致死的結(jié)核分枝桿菌死菌、6-cFDA染色可準(zhǔn)確鑒定結(jié)核分枝桿菌活菌，此為人們應(yīng)用FCM檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性與耐藥異質(zhì)性構(gòu)建了基礎(chǔ)性前提。目前我們尚未查見應(yīng)用6-cFDA染色鑒定結(jié)核分枝桿菌死、活的相關(guān)文獻(xiàn)，但對于PI染色鑒定結(jié)核分枝桿菌死、活，我們則注意到了羅燕輝等［16］有關(guān)PI不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌死、活菌的研究結(jié)果。本文與其結(jié)果的迥異是否源自PI染色時間的差異（文獻(xiàn)［16］的染色時間為15 min，本研究為30 min）目前不得而知，有待探究。

從表1我們可以看到：本實驗10例死菌PI染色MFI值的全距為4 081（5 967-1 886）、四分位間距為2 215（4 399-2 184），10例活菌6-cFDA染色MFI值的全距為11 544（13 530-1 986）、標(biāo)準(zhǔn)差為4 512。10例臨床分離株死菌經(jīng)PI染色后其熒光強(qiáng)度差異較大，反映出這10例臨床分離株死菌對PI染料的透過性和結(jié)合力差異較大。10例臨床分離株活菌經(jīng)6-cFDA染色后熒光強(qiáng)度差別較大，反映出各臨床分離株菌株酯酶表達(dá)量或其活力差異較大。這些數(shù)據(jù)充分說明：不同的臨床分離株，無論是經(jīng)非膜透性染料PI染過的死菌還是膜透性染料6-cFDA染過的活菌，其MFI值均具有較大的離散趨勢。盡管如此，活菌PI染色和死菌6-cFDA染色的MFI值較為集中，因此不影響這兩種染料對結(jié)核分枝桿菌死、活狀態(tài)的鑒定。同時，不同臨床分離株活力不同導(dǎo)致的染色后MFI值的差異，也從側(cè)面說明了PI和6-cFDA的MFI值能很好的反應(yīng)菌群中細(xì)菌活力的平均水平，具有進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的潛力。為了消除臨床分離株之間本身差異對檢測結(jié)果的影響，對檢測數(shù)值進(jìn)行歸一化處理，我們將更關(guān)注同一株臨床分離株經(jīng)藥物處理前后MFI值的比值，而非其MFI值本身。

表3 PI或6-cFDA染色鑒定結(jié)核分枝桿菌臨床分離株死、活的診斷性能Table 3 Diagnostic performance of PI or 6-cFDA staining for identification of dead or living clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis

另外，我們在應(yīng)用MFI界值鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的性能驗證實驗中發(fā)現(xiàn)：表2中的4號活菌經(jīng)PI染色后MFIPI=1 342，此值略高于PI染色判斷為死菌的界值（1 329），依據(jù)PI染色單個指標(biāo)來看該樣本應(yīng)判定為死菌；但樣本的制備過程及6-cFDA染色檢測結(jié)果指示受檢菌為活菌。為何如此？我們目前認(rèn)為原因可能只有一個：該活菌菌液中既存在大量活菌又存在低比例的死菌，其低比例死菌的存在導(dǎo)致了PI染色的假陽性，但目前還沒有很好的實驗可以證實死、活菌的混合性存在，我們所開展的包括本實驗在內(nèi)的系列研究即旨在解決菌液中細(xì)菌活力異質(zhì)性檢測問題（此為細(xì)菌異質(zhì)性耐藥檢測方法學(xué)中的關(guān)鍵技術(shù)問題）。這就提示我們：為最大限度消除受檢細(xì)菌生命活力非均一性的影響，應(yīng)用FCM檢測細(xì)菌死、活宜以采用雙染料染色為妥。尤其是在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測及異質(zhì)性耐藥檢測中我們必須慮及：抗結(jié)核藥物作用下的結(jié)核分枝桿菌的活力狀況可能遠(yuǎn)非加熱處死結(jié)核分枝桿菌之死、活截然分開的狀況。不同臨床分離株因其本身活力的差異，會存在藥物敏感性方面的差異，因此，同樣條件的藥物處理后不同的臨床分離株會有不同比例的菌處于復(fù)雜的死、活菌中間態(tài)。這就使應(yīng)用FCM進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測尤其是結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥檢測呈現(xiàn)諸多困難，同時也許是近些年來此方面研究不多而相應(yīng)技術(shù)止步不前的重要原因之一。但是FCM檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的方法相對于表型檢測法快速［17］，相對于基因型檢測法準(zhǔn)確，更具有定量檢測結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的潛力，正是這些優(yōu)勢敦促我們迎難而行。如何克服檢測樣本中細(xì)菌藥物敏感性差異帶來的非均一化問題將成為我們后續(xù)研究的難點，我們當(dāng)努力為之。