負壓封閉引流技術干預兔骨骼肌缺血再灌注損傷后炎性反應的實驗研究

陳駕君，楊 帆，解 杰，王 翔，高 偉，白祥軍

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院創(chuàng)傷外科，武漢 430030)

擠壓傷及擠壓綜合征是創(chuàng)傷救治中的常見傷，救治效果不佳，具有極高的病死率[1]。其主要危害機制為解除壓迫后的骨骼肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，I/R)，這種序貫性的損傷可導致失控性炎性反應，繼而出現(xiàn)全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[2]。缺血再灌注損傷發(fā)生和發(fā)展是擠壓綜合征中的重要環(huán)節(jié)，如何在源頭上控制炎性反應，減輕毒素回吸收對機體造成的危害，成為臨床研究的重點目標之一。本院創(chuàng)傷外科利用負壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)技術在臨床上治療擠壓傷取得了良好效果[3]，但是該技術通過對損傷骨骼肌的局部作用，減輕缺血再灌注損傷和繼發(fā)全身炎性反應的具體機制尚不明確。因此，筆者通過缺血再灌注損傷動物模型模擬擠壓傷，結合前期兔創(chuàng)面模型的相關實驗基礎[4-7]，來探討VSD技術在擠壓傷時對炎癥因子、炎癥細胞和炎性反應的干預作用，以闡明其在減輕骨骼肌缺血再灌注損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性新西蘭白兔30只，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，體質量2～3 kg，實驗前適應性飼養(yǎng)1周。本實驗所涉及的實驗動物飼養(yǎng)與科學操作均符合《實驗動物管理條例》。

1.2動物模型的建立 將新西蘭白兔按照150 mg/kg的劑量，從耳緣靜脈注射鹽酸氯胺酮注射液，麻醉成功后固定于操作臺。缺血再灌注損傷模型制備：將白兔左后腿中部以上的皮膚剃毛、消毒后剪開，于大腿根部游離股動、靜脈并予以保護，大腿中上水平切斷所有肌肉及神經，將離斷的肌肉進行原位縫合，使左下肢成為僅通過股動、靜脈及骨骼與肢體連接的組織塊；使用無創(chuàng)傷血管夾阻斷股動、靜脈造成下肢缺血(持續(xù)4 h)，然后放開血管夾，造成再灌注損傷(持續(xù)6 h)。

1.3實驗分組及干預 將30只實驗兔分為3組，即對照組、缺血再灌注組(I/R組)、VSD干預的缺血再灌注組(I/R+VSD組)，每組10只：(1)對照組動物僅完成組織游離，不進行左下肢靜脈的夾閉及開放；(2)I/R組動物完成組織游離后進行左下肢靜脈的夾閉及開放，不進行VSD干預；(3)I/R+VSD組的動物在進行再灌注的同時對損傷處予以VSD干預。術中VSD負壓控制在-125 mm Hg(-16.6 kpa)，各組實驗結束后將兔用空氣栓塞法處死，取相應部位組織進行生化指標測定和組織學分析，對外周靜脈血進行生化指標測定。

1.4儀器與試劑 (1)儀器：便攜式負壓吸引儀(武漢維斯第公司)、Cell-PYN Sapphire全自動血細胞分析儀(美國Abbott公司)。(2)材料：VSD一次性負壓引流護創(chuàng)材料(武漢維斯第公司)、特制飼養(yǎng)籠(武漢同濟醫(yī)院實驗動物中心)。(3)試劑：①酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)TNF-α和IL-6檢測試劑盒(北京博奧森公司)、PGE2檢測試劑盒(美國Ebioscience公司)、C5a檢測試劑盒(上?？祈樄?、CRP檢測試劑盒(美國Dade Behring公司)；②免疫組織化學法(IHC)小鼠CD11b試劑盒(上海賓智公司)、羊抗小鼠IgG(上海研生公司)；③蛋白免疫印跡法(Western blot)：小鼠hs-CRP試劑盒(上海研生公司)。

表1 各組家兔骨骼肌組織中各生化指標的表達情況

*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組比較；Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01，與I/R組比較；-：無數據

1.5樣本取材和檢測方法 (1)炎癥因子組織標本：各組實驗結束后，將兔處死，使用冰去離子水對獲取的兔左下肢骨骼肌組織進行沖洗并進行勻漿處理，使用低溫離心機以3 000 r/min離心10 min，取上清液以ELISA法進行TNF-α、IL-6、PGE2和C5a的檢測，嚴格按照試劑盒說明操作。(2)炎癥標志物組織標本：本實驗引入GAPDH蛋白作為內參，采用免疫印跡法檢測hs-CRP蛋白的表達。取漂洗干凈的骨骼肌組織，提取總蛋白進行15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并轉移至硝酸纖維素膜上，封閉過夜后依次加入鼠抗兔hs-CRP一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG二抗，使用化學發(fā)光法進行顯色。(3)炎癥細胞組織標本：同上，采用IHC法檢測組織內多形核中性白細胞(PMN)特異性標記物CD11b的表達。(4)炎癥因子血液標本：各組實驗結束后，將兔處死前，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1 mL，使用低溫離心機以3 000 r/min離心5 min，取上清液以ELISA法進行TNF-α和IL-6的檢測，嚴格按照試劑盒說明操作。(5)炎癥標志物血液標本：同上采用ELISA法，檢測兔外周靜脈血中CRP水平。(6)炎癥細胞血液標本：同上抽取靜脈血1 mL注入血常規(guī)試管，低溫保存，60 min內送往華中科技大學同濟醫(yī)院檢驗科，應用Cell-PYN Sapphire全自動血細胞分析儀自動進行WBC計數。

2 結 果

2.1骨骼肌組織中炎癥因子水平的變化 在建模過程中，I/R組和VSD組各有1只白兔死亡。與對照組比較，I/R組TNF-α、IL-6、PGE2和C5a水平均顯著增高(t=5.157，P<0.01)，I/R+VSD組TNF-α和C5a水平顯著增高(t=2.373，P=0.035)；與I/R組比較，I/R+VSD組的TNF-α、IL-6、PGE2和C5a均顯著降低(t=4.699，P<0.01)，見表1。

2.2骨骼肌組織中炎癥標志物水平的變化 免疫印跡法檢測結果顯示，對照組、I/R組和I/R+VSD組hs-CRP蛋白相對灰度比分別為0.738±0.467，2.341±0.773和1.299±0.391。統(tǒng)計學分析結果顯示，3組相對表達量差異具有統(tǒng)計學意義(F=45.453，P<0.01)，見圖1。

*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組比較；Δ：P<0.05，與I/R組比較

圖1 骨骼肌組織中炎癥標志物水平的變化

*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組比較；Δ：P<0.05，與I/R組比較；-：無數據

圖2 骨骼肌組織中炎癥細胞數量的變化

2.3骨骼肌組織中炎癥細胞數量的變化 免疫組化法檢測及圖像分析結果顯示，對照組、I/R組和I/R+VSD組PMN特異性標記物CD11b表達分別為113±58，362±101和252±87。統(tǒng)計學分析結果顯示，3組PMN細胞數差異具有統(tǒng)計學意義(F=26.448，P<0.01)，見圖2。

表2 各組家兔靜脈血中各生化指標的表達情況

*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組比較；Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01，與I/R組比較；-：無數據

2.4外周靜脈血中炎癥因子、炎癥標志物水平和炎癥細胞數量的變化 與對照組比較，I/R組TNF-α、IL-6、CRP水平和WBC數量顯著增高(t=9.247，P<0.01)，I/R+VSD組TNF-α、IL-6和CRP水平顯著增高(t=4.754，P<0.01)；與I/R組比較，I/R+VSD組的TNF-α、IL-6、CRP水平和WBC數量顯著降低(t=7.415，P<0.01)，見表2。

3 討 論

臨床上擠壓傷起病急驟，在機械力和再灌注損傷的雙重機制可迅速出現(xiàn)全身失控性炎性反應，同時常伴有急性腎功能不全，繼發(fā)各種器官功能損害，病死率較高，所以擠壓傷和擠壓綜合征是臨床上治療的重點和難點。擠壓綜合征發(fā)病機制主要為肌肉等組織受到機械力作用，直接損傷和缺血引起的變性、壞死及解除擠壓后再灌注損傷導致的自溶[8]。有時，即使擠壓時間不長，沒有造成嚴重的器質性損傷，也會由于解除擠壓后，組織內自由基釋放、細胞內鈣超載和橫紋肌壞死溶解，導致嚴重的炎性反應和不可逆的損傷。其中，骨骼肌是受缺血再灌注損傷最為敏感的機體組織[9]，缺血骨骼肌的細胞在恢復供血后的最初幾分鐘內即可發(fā)生再灌注損傷，裂解后誘導釋放各種炎癥因子，并經過靜脈回流，造成炎癥因子的全身播散和級聯(lián)反應。因此骨骼肌也是擠壓傷后缺血再灌注損傷預防和治療的研究重點。

VSD技術是近十年來新興的一種創(chuàng)面物理治療技術[10]，可明顯預防和改善創(chuàng)面感染，加快創(chuàng)面愈合，已廣泛應用于各種急慢性創(chuàng)面的治療中[11]。同時，國內外的臨床研究均表明[12-13]，應用VSD技術可有效改善擠壓傷和擠壓綜合征造成的危害，但是具體作用機制仍存在爭議。

適當的炎性反應可以將細胞因子水平維持在適當的水平，有利于細胞免疫和機體恢復；如果炎性因子過度釋放和調節(jié)失控，則會誘發(fā)全身炎癥反應綜合征(SIRS)，繼發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)。筆者推測，在缺血再灌注損傷中，VSD技術利用其負壓抽吸作用，可以有效去除組織內積聚的有害物質[14]，減少炎癥因子釋放及炎癥細胞的進一步趨化，下調炎性反應，從而減輕擠壓傷后再灌注損傷引起的一系列嚴重后果，預防MODS的發(fā)生。在炎性反應中，最為重要的炎癥因子是TNF-α、IL-6、PGE2和C5a，分別具有啟動炎性反應、活化炎癥因子、引起血管通透性增高和趨化炎癥細胞的作用。TNF-α是參與創(chuàng)傷后機體炎性反應的主要細胞因子之一[15]。IL-6則可由多種細胞合成和釋放，通過刺激血小板活化因子協(xié)同TNF-α放大炎性反應[16]。PGE2是花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產物，是前列腺素的一種，其作用為擴張血管，升高血管通透性，利于炎癥細胞進出血管壁[17]。C5a是存在于血清與組織液中的一種經活化后具有酶活性的蛋白質?；罨?，高濃度的C5a是中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞的趨化劑，可刺激這些細胞沿著濃度定向移動致?lián)p傷部位發(fā)揮炎性反應[18]。WBC是一種非特異性免疫的直接效應細胞，活化的WBC還可以通過釋放炎癥因子、增加血管通透性、產生趨化作用等參加局部的炎性反應。除非發(fā)生免疫抑制，WBC的增高是全身炎癥水平最為基礎的評判指標，而PMN是白細胞中主要的效應細胞[19]。CRP則主要是在IL-6等細胞因子調節(jié)下，主要由肝臟合成分泌的一種蛋白質，也可由炎癥局部的巨噬細胞少量產生。CRP以糖蛋白的形式存在于血液中，能增強白細胞的吞噬能力、增強淋巴細胞活性、激活補體等作用。CRP是急性時相蛋白(acute phase protein，APP)中變化最敏感的一種，而hs-CRP則是目前評價炎癥最為敏感的指標之一[20]。因此，減少創(chuàng)傷處的局部炎癥因子，是阻斷缺血再灌注損的源頭，預防全身失控性炎性反應和繼發(fā)MODS的重要途徑之一。

通過本實驗可證實，VSD技術不僅可明顯下調再灌注損傷后兔骨骼肌局部的炎癥因子(TNF-α、IL-6、PGE2和C5a)的生成和表達，同時減少局部骨骼肌炎癥細胞(PMN)的浸潤，降低局部炎性反應；繼而減少炎癥因子(TNF-α和IL-6)進入外周循環(huán)，改善全身炎性反應，避免失控性炎性反應的發(fā)生，從而最終預防MODS。

綜上所述，本實驗通過VSD技術，減少兔骨骼肌缺血再灌注損傷模型中炎癥因子的表達，控制炎癥細胞趨化，可有效下調局部和全身的炎癥水平。結合筆者之前的實驗數據[3-4,21]，為其用于治療擠壓傷-擠壓綜合征-缺血再灌注損傷提供了理論依據。