靈芝養(yǎng)肝丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1.山東省萊蕪市食品藥品檢驗檢測中心，山東 萊蕪 271100；2.五礦集團(tuán)魯中礦業(yè)有限公司職工醫(yī)院，山東 萊蕪 271100

靈芝養(yǎng)肝丸為萊蕪市中醫(yī)醫(yī)院制劑品種，具有疏肝利膽、行氣化濕的功效，適用于脂肪肝、乙肝、膽系感染等癥。靈芝養(yǎng)肝丸由17味藥組成，組方復(fù)雜，原批準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較簡單，達(dá)不到控制質(zhì)量的目的。為了更好的控制藥品質(zhì)量，增加了對組方中豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草的顯微鑒別，大黃、黃連的薄層色譜鑒別和高效液相色譜法測定赤芍中芍藥苷的含量，從而較全面的反應(yīng)包括投料在內(nèi)的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Shimadzu LC-20A高效液相色譜處理系統(tǒng)(日本)；梅特勒-托利多XS105DU電子分析天平(瑞士)；科哲生化薄層色譜成像系統(tǒng)；KQ-250DE超聲波清洗器；BX-51奧林巴斯顯微鏡。

1.2 材料 靈芝養(yǎng)肝丸(批號：180524、180607、180620，萊蕪市中醫(yī)醫(yī)院)；大黃(批號：120902-201311)；黃連(批號：120913-201611)；芍藥苷(批號：110736-201842)對照藥材與對照品均為中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微情況 取本品適量，用水溶散，取沉淀物共裝10個載玻片置顯微鏡下觀察：菌絲散在或黏結(jié)成團(tuán)，無色或淡棕色，細(xì)長，稍彎曲，有分枝(靈芝)。菌絲間有草酸鈣方晶，大多呈正方八面體形等(豬苓)。草酸鈣簇晶大，直徑60～140 μm(大黃)。導(dǎo)管群放射狀排列，導(dǎo)管旁有木纖維(赤芍)。石細(xì)胞鮮黃色，單個或成群散在(黃連)。石細(xì)胞分支狀，壁厚，層紋明顯(厚樸)。纖維束周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維(甘草)。如圖1～7所示。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 大黃的TLC鑒別 取本品0.6 g,加甲醇20 mL，浸漬1 h，濾過，取濾液5 mL，蒸干，殘渣加水5 mL溶解，再加鹽酸0.5 mL，置水浴上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚20 mL，分2次(10 mL、10 mL)振搖提取，合并乙醚提取液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。再取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。另取處方中除去大黃的其他藥味，按處方比例制成缺大黃的陰性對照樣品。取陰性對照樣品2 g，同供試品溶液的制法，制成陰性對照溶液。分別取上述3種溶液各4 μL，分別點在硅膠G薄層板上，石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的5個橙色熒光斑點；置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，顯相同的紅色斑點。陰性對照在相應(yīng)位置沒有斑點，表明陰性對照無干擾。如圖8～9所示。

2.2.2 黃連的TLC鑒別 本品1 g剪碎，加甲醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。再取黃連對照藥材0.25 g，同法制成對照藥材溶液。另取處方中除去黃連的其他藥味，按處方比例制成缺黃連的陰性對照樣品。取陰性對照樣品2 g,同供試品溶液的制法，制成陰性對照溶液。分別取上述三種溶液各2 μL。分別點在硅膠G薄層板上，甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6∶3∶1.5∶2∶0.3)為展開劑，在另槽中加入等體積的濃氨試液，預(yù)平衡15 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照在相應(yīng)位置沒有斑點，表明陰性對照無干擾。如圖10所示。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜的條件 C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)；速度：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于3000。

2.3.2 制備對照品溶液 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

2.3.3 制備供試品溶液 取本品10丸，剪碎，稱取5 g，精密稱定，加入等量硅藻土，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 制備陰性對照溶液 按處方比例制成不加赤芍藥材的陰性樣品，按照供試品溶液方法2.3.3制成陰性對照溶液。

2.4 方法學(xué)的考察

2.4.1 線性范圍 分別精密吸取濃度為0.06 mg/mL的芍藥苷溶液各2、5、10、15、20、30 μL，注入液相色譜儀，分別測定峰面積積分值。以對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對照品峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:y=88224x- 8993.3，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。試驗結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.06～1.8 μg之間進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 儀器精密度試驗 精密吸取芍藥苷對照品溶液(0.06 mg/mL)5 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測其峰面積積分值。結(jié)果RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 樣品穩(wěn)定性試驗 取樣品(180524)照上述方法實驗。每隔5 h進(jìn)樣1次，每次5 μL，測定芍藥苷的峰面積積分值，共5次，結(jié)果RSD為0.50%，表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 方法重復(fù)性考察 取同一批號(批號：180607)的樣品6份，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)行測定，計算含量與RSD，結(jié)果表明，靈芝養(yǎng)肝丸供試品中芍藥苷的含量為0.93 mg/g。RSD為1.89%，表明含量測定方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已測知含量的本品適量(批號：180607，芍藥苷的含量為0.93 mg/g)，剪碎，取約2.5g，精密稱定，加入等量硅藻土，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入芍藥苷對照品溶液(濃度為：0.06 mg/ml)40 mL、甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，計算。結(jié)果表明，測定方法的回收率良好。見表1。

表1 加樣回收率考察結(jié)果

2.4.6 專屬性試驗 將對照品溶液、樣品溶液及陰性對照溶液，依次進(jìn)行測定，按照“2.3.1”設(shè)定的色譜條件進(jìn)行實驗。圖譜表明：陰性對照無相應(yīng)色譜峰，可認(rèn)為在此方法下該樣品中其他組成部分對實驗沒有影響。結(jié)果如圖11～13所示。

2.5 樣品測定 取3批樣品，按“2.3.3”項下方法得到的樣品溶液，按照預(yù)設(shè)的條件進(jìn)行實驗，根據(jù)所得的峰面積得到樣品中芍藥苷的含量。結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷含量測定結(jié)果

3 討論

實驗參考藥典方法[1]，分別采用顯微鑒別法對豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草進(jìn)行鑒別，各品種特征明顯可見。用高效液相色譜法測定赤芍中芍藥苷的含量，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，采用高效液相色譜法測定了赤芍中芍藥苷的含量?？疾炝税步輦?1200、島津 LC-20A兩種儀器和Inertsil ODS-3(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；Agilent 5 TC-C18(4.6 mm × 150 mm，5 m)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)3種色譜柱的影響。兩種儀器和上述3種柱子由計算所得可知實驗?zāi)陀眯詽M足要求，該方法操作簡便，樣品中芍藥苷峰與雜質(zhì)峰完全分離，分析時間短，重現(xiàn)性良好。

根據(jù)相關(guān)資料[2-5]，進(jìn)行大黃、黃連的薄層色譜法適用性試驗，考察了不同的溫濕度(16℃、26℃，32%、65%、88%)和薄層板(Merck、青島海洋、煙臺大學(xué)科工所、自制板)，均得到了滿意結(jié)果。該方法適用于靈芝養(yǎng)肝丸的測定。