3種四逆湯抗膿毒癥的藥效學(xué)差異及急性毒性研究

1.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011；2云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650000；3昆明市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，云南 昆明 650000

四逆湯是仲景名方，被譽為“回陽救逆第一方”。全方由附子、干姜、炙甘草三味藥組成，是治療少陰病陽虛陰盛證的主方，以陰盛陽衰，致四肢厥逆而命名;嘔吐、下利清谷、四肢厥逆、表熱里寒、下寒上熱、真寒假熱、脈沉微、沉遲、微細、脈微欲絕等，是本方的適應(yīng)證?，F(xiàn)代中醫(yī)運用四逆湯治療臨床各科危重癥，凡具有心腎陽虛病理特點者，均可用該方治療，并取得了較好的臨床效果[1-2]，筆者在長期的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，在四逆湯的臨證運用中，對該經(jīng)方中君藥附子的用法和用量各家存在較大差異，《傷寒論》中四逆湯原方使用生附子入藥，原著中四逆湯附子的用法為“一枚生用去皮破八片”，此“一枚”者，一般為10～15 g，在2010版《中國藥典》中規(guī)定的四逆湯使用附片入藥，劑量為“3～15 g”，以吳榮祖教授為代表的云南吳氏扶陽學(xué)術(shù)流派，經(jīng)過長年的實踐，積累了大量成熟運用四逆湯的臨床經(jīng)驗，吳氏在組方上重用附子，采用附片入藥，劑量可用到100 g。由于不同醫(yī)家使用四逆湯時附子的用法和用量差異較大，在藥效學(xué)及毒性上是否也存在差異，目前尚不清楚，因此，本研究根據(jù)四逆湯主治諸證之癥狀與現(xiàn)代臨床膿毒癥休克的癥狀較為相似的特點，且有多項臨床及藥理研究亦表明四逆湯具有抗多種休克的臨床療效[3-4]，本實驗選擇了小鼠膿毒癥模型為研究對象，對《傷寒論》組成四逆湯(下稱：傷寒四逆湯)、《中國藥典》組成四逆湯(下稱：藥典四逆湯)以及吳榮祖教授經(jīng)驗組成四逆湯(下稱：吳氏四逆湯)抗膿毒癥的藥效學(xué)進行了比較研究，并對3種四逆湯小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性差異進行了比較，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物 藥典四逆湯(組成：附片15 g，干姜10 g，炙甘草15 g)，傷寒四逆湯(組成：生附子15 g,干姜23.4 g,炙甘草31.2 g)，吳氏四逆湯(組成：附片100 g，干姜20 g，炙甘草10 g)。

1.2 動物 昆明種健康小鼠160只，雌雄各半，體重量(20±2) g，SPF級，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.3 試劑 附片、干姜、炙甘草飲片均購自慈慧藥業(yè)有限公司，生附子購自中國中藥公司四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，經(jīng)昆明市中醫(yī)醫(yī)院馬雁滔中藥師鑒定為正品；小鼠TNF-α(批號：20170801)、IL-1β(批號：20170805)、IL-6(批號：20170804)ELISA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；95%乙醇，購自天津市致遠化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 臺式微量高速離心機(日立工機株式會社，型號CF16RXⅡ);酶標(biāo)儀(InfiniteM200PRO，瑞士Tecan公司)；超純水系統(tǒng)(美國Millipore，型號ZMQS50F01)。

1.5 方法

1.5.1 3種四逆湯受試物的制備 按各組方十倍量稱取附子，加8倍量蒸餾水煮沸1 h，稱取干姜、炙甘草加入，同時加入8倍量蒸餾水共煎1 h。過濾，藥渣加6倍量蒸餾水煮沸2 h。過濾，再次加6倍量蒸餾水煮沸1 h。合并3次濾液濃縮至相應(yīng)體積(膿毒癥模型所用各組方均按人和動物的體表面積換算為臨床人用量的一倍量，根據(jù)臨床藥效量換算出小鼠用藥典四逆湯劑量為5.2 g生藥/k g，傷寒四逆湯劑量為9 g生藥/kg，吳氏四逆湯為16.9 g生藥/kg；急性毒性實驗時將各方水煎液濃縮至能通過小鼠12號灌胃針頭的最大濃度)。冷卻至室溫，4 ℃冰箱備用。

1.5.2 盲腸結(jié)扎穿孔致小鼠膿毒癥模型的復(fù)制 昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機分為4組：假手術(shù)組、藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組。每組雌雄各10只。術(shù)前禁食不禁水12 h，參考文獻方法[5]建立盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥小鼠模型，KM種小鼠以1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后腹部消毒備皮，無菌條件下沿腹部正中線作1 cm切口，找到盲腸，于盲腸根部至回盲瓣1/3處用4號手術(shù)縫合線結(jié)扎盲腸，用18號針穿刺盲腸2次，擠出少量腸內(nèi)容物，隨后將盲腸納入腹腔，縫合手術(shù)切口，小鼠術(shù)后3 h腹部皮下注射25 mg/kg亞胺培南西司他丁鈉作抗感染處理。假手術(shù)組小鼠除盲腸不結(jié)扎和穿刺外，其余操作與手術(shù)組相同。術(shù)后觀察小鼠狀態(tài)，記錄小鼠存活情況。造模后一天開始灌胃給予相應(yīng)的藥物，假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水，連續(xù)給予14 d。

1.5.3 炎癥因子的測定 末次給藥后2 h，各組小鼠眼底靜脈叢取血約1 mL，靜置2 h，3000 rpm離心10 min，取上清液按照試劑盒操作說明檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.5.4 肺、肝組織HE染色 所有動物脫頸椎處死，分離頸部，暴露氣管，從氣管中段剪口，用注射器將10%福爾馬林溶液經(jīng)氣管灌入肺組織中，小心摘除心臟和其他附屬組織，完整取出肺組織。剪開腹腔，取出肝臟組織。取出的組織立即投入盛有10%福爾馬林溶液的固定瓶中浸泡固定。

1.5.4.1 肺組織病理制片 取左肺于常溫下固定48 h后，清水漂洗組織塊2 h后進依次放入為75%，86%，95%Ⅰ、Ⅱ的乙醇各30 min，100%Ⅰ、Ⅱ乙醇各20 min進行組織脫水，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min透明后，放入石蠟Ⅰ30 min，石蠟Ⅱ1 h，石蠟Ⅲ2 h浸蠟，然后石蠟包埋，制作成4 μm厚的切片。將切片放入65 ℃的烘箱中烘烤30 min，行HE染色。最后中性樹膠封片，鏡檢。

1.5.4.2 肝組織病理制片 取肝右葉于常溫下固定48 h后，清水漂洗組織塊2 h后進行組織脫水。脫水條件如下：依次放入質(zhì)量分數(shù)為75%，85%，95%Ⅰ、Ⅱ的乙醇各1 h，100%Ⅰ、Ⅱ乙醇各30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，石蠟Ⅰ30 min，石蠟Ⅱ1 h，石蠟Ⅲ2 h，然后石蠟包埋，制作成4 μm的切片。余下步驟與上同。

1.5.5 急性毒性實驗 經(jīng)預(yù)實驗，3種四逆湯水煎濃縮液在最大濃度、最大灌胃體積下小鼠灌胃，動物無死亡，故進行最大給藥量的測定。取昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機分為4組：正常組、藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組。每組雌雄各10只。試驗前禁食不禁水12 h，藥典四逆湯組灌胃給藥劑量為256 g/kg體重，傷寒四逆湯組灌胃給藥劑量為125 g/kg體重，吳氏四逆湯組灌胃給藥劑量為288 g/kg體重，假手術(shù)組給予等體積的生理鹽水，給藥體積為0.4 mL/10g。給藥后連續(xù)觀察14 d，每天觀察各組動物的外觀、行為和毒性行為，記錄動物的體重、進食量。試驗第14 d處死、解剖小鼠，觀察其主要臟器的外觀。

2 實驗結(jié)果

2.1 3種四逆湯對膿毒癥小鼠死亡率的影響 結(jié)果顯示，假手術(shù)組全部存活，造模后少數(shù)動物出現(xiàn)死亡，解剖可見盲腸下端腸與腹壁粘連。3種四逆湯對小鼠盲腸結(jié)扎穿孔法致膿毒癥模型具有生存保護作用，可降低小鼠死亡率。各組動物死亡情況見表1。

表1 3種四逆湯對膿毒癥小鼠死亡率的影響 (n=20)

注：死亡率(%)=死亡數(shù)/(死亡數(shù)+存活數(shù))。

2.2 3種四逆湯對膿毒癥小鼠血清炎癥因子的影響 結(jié)果顯示，小鼠盲腸結(jié)扎穿孔法致膿毒癥模型建立后，血清中炎癥因子明顯增高；給予3種四逆湯干預(yù)后，吳氏四逆湯可明顯減少模型動物血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，藥典四逆湯可明顯減少血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量，傷寒四逆湯僅可明顯減少炎癥因子TNF-α的含量結(jié)果見表2、圖1。

表2 3種四逆湯對膿毒癥小鼠血清炎癥因子的影響

注：與正常組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 3種四逆湯對膿毒癥小鼠肺組織損傷的影響

假手術(shù)組顯示肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔干凈。模型組小鼠肺組織內(nèi)均可見肺泡壁內(nèi)、肺泡腔內(nèi)細胞增多，主要為肺泡巨噬細胞和淋巴細胞增多，肺泡壁明顯增厚，炎癥明顯。藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組細胞增生情況較模型組減輕，見圖2。

各組肺切片均可見少量的肺泡內(nèi)出血現(xiàn)象，各組之間在出血量、出血部位等方面均無明顯差異，考慮此肺泡內(nèi)出血與頸椎脫臼處死方式有關(guān)，頸椎脫臼可使頸部氣管受損，從而出血，血液自然下流或氣管內(nèi)注射固定液均可將血液帶入肺泡腔內(nèi)。

2.4 3種四逆湯對膿毒癥小鼠肝臟損傷的影響 假手術(shù)組顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列規(guī)則，匯管區(qū)干凈。模型組炎性細胞浸潤明顯，有多個散在的肝細胞小灶性的變性壞死。藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組肝細胞形態(tài)基本正常，肝細胞變性較輕，有輕微的炎性浸潤，偶見點狀壞死，見圖3。

2.5 3種四逆湯經(jīng)口給予小鼠的急性毒性的影響 結(jié)果顯示，給藥后14 d內(nèi)，藥典四逆湯組和吳氏四逆湯組動物未見死亡，一般狀況良好，飲食、二便正常，且外觀、皮毛、行為、呼吸均正常，鼻、眼、口腔無異常分泌物，未見其它明顯異常反應(yīng)。各給藥組與正常組的體重增長變化趨勢基本一致，進食量隨體重的增長而增加。傷寒四逆湯組動物在給藥12 h內(nèi)有些微腹瀉情況，第3天即恢復(fù)正常，但未見死亡。試驗結(jié)束后觀察各組主要臟器無明顯異常，表明3種四逆湯在常規(guī)劑量下使用是安全的。小鼠單次給藥的最大給藥量：吳榮祖教授經(jīng)驗方四逆湯(288 g生藥/kg)>《中國藥典》收錄四逆湯(256 g生藥/kg)>《傷寒論》記載四逆湯(125 g生藥/kg)。

5 討論

四逆湯是溫補心腎，通脈止痛的代表方，臨床應(yīng)用廣泛，可治療多種休克、冠心病、心絞痛等疾病，均具有顯著療效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該方具有強心、抗休克、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。該方應(yīng)用雖廣，但各家用四逆湯時附子的用法和用量差異較大，而藥效學(xué)及毒性是否有差異尚不清楚，需深入探究附子的用法和用量對該方作用影響，為臨床安全有效用藥提供理論依據(jù)。

膿毒癥是一種嚴重的臨床疾病，是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，在過去30年中，盡管最新研究表明抗生素治療和重癥監(jiān)護取得了進展[6]，但其病死率仍高達30%～50%，已成為住院和醫(yī)療費用的主要原因之一[7]，探索規(guī)范和有效的治療手段和藥物，實屬當(dāng)務(wù)之急，也無疑具有重要的理論價值及臨床意義。從癥狀學(xué)的角度來看，《傷寒論》中四逆湯諸證與膿毒癥的臨床癥狀十分相似，而多項臨床及藥理研究亦表明，四逆湯對各類休克具有一定的治療作用，但以往開展的與其作用機制相關(guān)的藥理研究主要集中于強心和改善微循環(huán)等方面，均不能很好解釋其回陽救逆功效的內(nèi)涵。近年來的研究表明，細胞因子激活是宿主對感染的防御反應(yīng)的一部分，但過度分泌和分泌細胞因子會引起廣泛的組織損傷和器官衰竭[8]。TNF-α和IL-6參與了膿毒癥引起的組織損傷，被認為是膿毒癥或膿毒性休克等嚴重炎癥疾病的主要調(diào)節(jié)因子[8-9]。IL-1β是膿毒癥時促炎反應(yīng)的主要炎癥因子[10]，可以直接反映動物機體受損的嚴重程度。在本實驗中，3種四逆湯對小鼠盲腸結(jié)扎穿孔法致膿毒癥模型具有生存保護作用，降低小鼠死亡率。同時，3種四逆湯均可不同程度降低小鼠膿毒癥模型血清中炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6的水平，抑制炎癥反應(yīng)。吳榮祖教授經(jīng)驗方四逆湯重用附子，在本實驗研究中顯示其對TNF-α，IL-1β，IL-6三個炎癥因子均顯示了明顯的抑制作用，其中以抑制炎癥因子TNF-α的作用更為明顯。

為進一步比較3種四逆湯急性毒性的差異，本實驗對小鼠進行了經(jīng)口給藥的急性毒性實驗研究。在最大濃度、最大灌胃體積下給予小鼠灌胃，小鼠未出現(xiàn)死亡及明顯毒性反應(yīng)，故測定其經(jīng)口給藥的最大給藥量。給藥后小鼠一般狀況良好，飲食、二便均正常，無異常分泌物。小鼠單次給藥的最大給藥量：吳榮祖教授經(jīng)驗方四逆湯(288 g生藥/kg)>《中國藥典》收錄四逆湯(256 g生藥/kg)>《傷寒論》記載四逆湯(125 g生藥/kg)，吳氏四逆湯小鼠經(jīng)口給藥的最大給藥量為臨床成人用量的155倍，提示臨床用藥是安全的。

通過本實驗的研究，提示，四逆湯中附子的用法和用量的不同在藥效學(xué)及安全性方面可產(chǎn)生一定的差異，但由于本實驗在藥效學(xué)方面僅對膿毒癥模型進行了考察，在四逆湯的其它藥效學(xué)方面的差異尚需進行大量深入系統(tǒng)的比較研究。