抗菌肽及其在水產養(yǎng)殖業(yè)的應用（四）

文/王玉堂

上接2019年4期

八、魚類基因工程抗菌肽的研究

迄今為止，應用于生產中的抗菌肽主要有四種獲取方式：一是天然提取法，即直接從動植物個體中提取，但來源有限。二是化學合成法，即通過連接氨基酸殘基合成抗菌肽，一般小于10個氨基酸殘基的多肽合成較為經(jīng)濟，10個以上氨基酸殘基的多肽合成較為昂貴。三是酶解法，即利用水解酶本身不具有活性的蛋白質，使其成為具有活性的肽鏈。四是基因工程方法，即利用分子生物學手段，通過原核或真核表達系統(tǒng)表達抗菌肽目的基因。采用基因工程方法生產抗菌肽具有成本低、易于工業(yè)化大規(guī)模生產等特點，是目前國內外研究者的首選。基因工程抗菌肽的研究主要集中在兩個方面：一是在分子水平上研究抗菌肽在動物免疫防御系統(tǒng)中的發(fā)生和調控機制，為抗菌肽相關產品的研發(fā)利用提供理論依據(jù)；二是克隆抗菌肽基因，利用微生物系統(tǒng)進行表達，然后利用蛋白質操作技術平臺進行收集和提純。

（一）原核系統(tǒng)表達抗菌肽的研究

大腸桿菌的原核表達系統(tǒng)是迄今為止在基因工程領域應用最多和最完善的系統(tǒng)，這個系統(tǒng)具有成本低、產量高、易于操作等優(yōu)點；缺點是抗菌肽對原核表達細胞具有很強的殺傷力，所以有時采用融合表達方式。李偉等（2007）從大菱鲆肝臟中鑒定得到hepcidin抗菌肽基因，并構建了谷胱甘肽-S轉移酶抗菌肽（GST2-hep）融合表達載體，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的融合表達。張虹等從斑點叉尾鮰肝臟中克隆了抗菌肽（LEAP-2），構建了“PET32a-IpL-2”的重組表達質粒，轉化至大腸桿菌BL21，得到可溶性融合抗菌肽產物。

雖然融合表達能增加抗菌肽在表達過程中的穩(wěn)定性，但是，融合標簽的存在可能會影響到抗菌肽本身的天然活性。

汪開毓等（2 0 1 8）就斑點叉尾鮰7種常見抗菌肽：Hepcidin，liver-expressedAMP2（LEAP2），bactericidal permeability-in-creasing protein(BPI)，cathepsin D，NK-ly-sin typel，NK-lysin type2，NK-lysin type3進行研究，通過生物信息學軟件對7種抗菌肽進行分析，并對其功能片段進行克隆，隨后將目的片段融合于PTWINI（含幾丁質標簽和內含肽）表達載體內含肽的N端，通過摸索誘導條件使內含肽與目的蛋白質之間的肽鍵斷裂，從而獲得不含任何標簽蛋白質的抗菌肽。目前，該試驗已成功構建了幾種抗菌肽的重組質粒PTWINIAMP，若能成功地將表達的抗菌肽與融合標簽分離開來，將會對抗菌肽的后續(xù)研究有重要意義。

采用原核表達系統(tǒng)雖然能夠實現(xiàn)抗菌肽的高效表達，但也存在諸多問題。首先就是抗菌肽的宿主細胞毒性。宿主細胞表達的抗菌肽：一是會反饋性地抑制宿主細胞增殖，從而影響抗菌肽的進一步表達。二是容易被降解，由于抗菌肽在表達過程中對蛋白質酶非常敏感，抗菌肽本身帶有大量正電荷，在宿主細胞中容易被降解，難以實現(xiàn)大量表達。三是大腸桿菌缺乏翻譯后修飾加工機制，表達的蛋白質不能進行正確的折疊，常以包涵體形式上存在，影響生物活性，需要進行變性、復性等復雜操作才能得到活性蛋白質，有時不適合表達結構復雜的蛋白質。因此，在原核表達方面，如何保持其結構與活性的同時，降低其細胞毒性是急需解決的問題。

（二）真核系統(tǒng)表達抗菌肽的研究

酵母作為工程菌表達外源蛋白質技術是近年來日益增長發(fā)展起來的真核表達體系。酵母作為低等真核生物具有細胞生長快、營養(yǎng)要求低、易于規(guī)?；a、遺傳操作簡單等特點，能夠對表達的蛋白質進行正確加工、修飾及合理的空間折疊，不會產生內毒素，有雌酵母的表達產物分泌于胞外，既可以減輕宿主細胞代謝負荷，又可減少宿主細胞蛋白質酶對外源蛋白質的降解，提高蛋白質表達活性，可獲得較高的表達量，利于表達產物的分離純化，非常有利于對真核生物基因的表達。

雖然酵母表達系統(tǒng)是抗菌肽基因應用最為理想的表達系統(tǒng)之一，但也受到宿主菌狀態(tài)、轉化基因表達效率、內源蛋白質酶活性等諸多因素的影響，其表達結果不理想的報道也常見。因此，抗菌肽是否適合酵母中表達，需要根據(jù)其活性特點具體分析，針對不同類型采取不同策略來構建表達載體，從而實現(xiàn)抗菌肽的高效高質表達。

隨著魚類相關文庫和蛋白質表達譜的建立以及基因工程技術的發(fā)展，表達和利用抗菌肽基因將會更加方便。天然抗菌肽基因經(jīng)過有目的地人工設計和改造，可以生產穩(wěn)定性更高、活性更強的抗菌肽，對抗菌肽基因篩選、改造設計以及表達載體篩選方面的深入研究，可提高基因表達的高效性和穩(wěn)定性，基因工程抗菌肽替代天然抗菌肽在理論和實踐上是完全可行的。

九、抗菌肽在水產養(yǎng)殖業(yè)中存在的問題及未來研究重點

（一）存在問題

雖然人們對抗菌肽的分離、結構和功能研究逐漸深入，但實現(xiàn)商業(yè)化生產和應用的產品較少。因為在應用領域還存在許多問題。

1.商業(yè)化生產難度大

因為抗菌肽主要是由生物機體自身產生，含量低，從生物體中分離和提純難度大。研究表明，可通過營養(yǎng)調控來控制內源抗菌肽的表達，利用維生素D3是最主要的手段。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸、鋅、多糖和精氨酸等也可以對抗菌肽的表達發(fā)揮調控作用。但是，這種營養(yǎng)調控手段還研究得不夠深入和全面，能達到治療效果的產品有限。人工合成方法雖然能解決抗菌肽量化生產問題，但生產成本高，產量低，活性或功效低等。

利用基因工程技術進行抗菌肽基因表達以降低生產成本和提高產量，可以達到量化生產的目標，這也是目前人們研究的重點。在桿狀病毒表達系統(tǒng)、原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)中，根據(jù)不同種類抗菌肽的特點，選擇和優(yōu)化抗菌肽表達系統(tǒng)至關重要。但是，抗菌肽具體結構與其功能密切相關，體外合成的抗菌肽與天然抗菌肽雖然一級結構一致，但空間結構存在一定差異，往往活性較差，因此，基因工程合成抗菌肽與天然抗菌肽的功能差異還有待于進一步研究。

2.天然抗菌肽的生物活性低

天然抗菌肽的生物活性低、效果不理想，穩(wěn)定性差，容易被蛋白酶水解。如何提高天然抗菌肽活性是一大難題。有科研人員采用生物化學方法對抗菌肽的分子結構等進行改造，利用構效原則來提高其生物活性和穩(wěn)定性。現(xiàn)階段主要有以下四種方法：嵌全形成雜全肽；利用生物化學手段改造天然抗菌肽；載取天然抗菌肽活性片段；通過肽文庫與計算機模擬進行高能量篩選。

目前，抗菌肽在水產養(yǎng)殖動物上的應用產品和產量還較少，大量的研究主要集中在其作為飼料添加劑來增強養(yǎng)殖動物的免預防作用，雖然這些研究取得一些進展，但大都是采用其它物種的抗菌肽作為水產養(yǎng)殖動物的飼料添加劑，雖有一定效果，但具有“種屬”專一性或特異性的抗菌肽對水產養(yǎng)殖動物的強效和更多的小副作用等問題還有待于進一步研究。

魚類的抗菌肽種類很多，哪些種類具有更好的療效和更好的經(jīng)濟性需要進一步探索?？咕牡母弊饔脝栴}也有待于進一步研究。姜珊等發(fā)現(xiàn)抗菌肽添加過量會導致羅非魚的增重率下降，這可能是因為高濃度的抗菌肽會抑制羅非魚腸道中有益菌群的生長，從而影響動物的消化吸收功能。由于抗菌肽抗菌譜廣、殺傷力強，對宿主細胞甚至也有一定的毒性，如何在保持其結構與活性的同時降低其細胞殺傷力需要到時候深入的研究。

3.抗菌肽并不是抗生素

有些人對抗菌肽了解和認識不深，擔心抗菌肽會產生抗菌素樣作用以及細菌耐藥性等問題。其實，抗菌肽與抗生素是有本質區(qū)別的。

（1）來源不同。抗生素是由微生物（細菌、真菌、放線菌等）在生活過程中所產生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產物，如青霉素來源于青霉菌產生的次級代謝產物。而抗菌肽是指生物體內經(jīng)誘導而產生的多肽物質。

（2）生產方式不同。抗生素是一系列酶促反應產物。而抗菌肽是通過基因編碼合成，由DNA到RNA到蛋白質（多肽），合成迅速。

（3）對機體的免疫作用不同。許多抗生素不能提高機體免疫力，甚至還對免疫有抑制或損傷作用。而抗菌肽為宿主防制性肽，在宿主先天免疫系統(tǒng)中有重要的調節(jié)作用，能提高機體的非特異性免疫能力。

（4）抗病原生物活性不同?？股刂饕强咕饔?，而抗菌肽具有多種生物活性，除對細菌的抑制或殺滅作用外，對真菌、病毒、原生蟲都有一定的抑制或殺滅作用。

（5）抗菌機制不同?？股卮蠖嗍峭ㄟ^抑制細菌細胞壁或DNA的合成而發(fā)揮作用，通常有特定的作用位點，與細菌細胞膜上或胞內特異的靶位結合，且靶位類型有限，細菌容易通過變異產生耐藥性。而抗菌肽主要作用于細菌的細胞膜上，通過與細細胞膜相互作用改變脂雙層膜構造，造成膜的物理性損傷，破壞細胞膜的完整性，使細胞膜的通透性增加，細胞內外滲透壓失衡，細胞內容物外泄，致使細菌死亡而起到殺菌作用?？咕牡淖饔貌簧婕疤囟ò形?，完全是陰陽離子的物理作用，由于細菌表面的結構和帶電性能無法改變，因此而很難產生抗藥性。

（二）未來研究重點

由于抗菌肽替代抗生素的研究是近幾年才發(fā)展起來的，雖然取得了一定進展，但還處于探索階段，距離技術成熟、大規(guī)模生產和應用到動物養(yǎng)殖中還有很多需要解決的問題。一是抗菌肽的種類很多，哪些種類作為飼料添加劑時效果好，又比較經(jīng)濟。二是不同種類的抗菌肽之間的相互作用情況。三是抗菌肽在動物體內的含量較少，天然資源匱乏，化學合成的成本太高，目前還無法實現(xiàn)規(guī)模化生產；需要從基因工程技術方法方面研究如何大規(guī)模生產抗菌肽，或通過日糧因素調控抗菌肽基因的表達。四是抗菌肽在動物體內容易被蛋白酶水解，需用脂質包被或對其進行化學修飾保護，這需要對其釋放機制、受體結合、降解活性及其類似物的結構與活性等進行研究。五是目前對抗菌肽作為飼料添加劑真正在實際生產方面的試驗還較少，其效果及是否有副作用還需進一步研究證實。