透明化骨骼染色鑒定海馬種類的方法

文/梁亮堂

在外觀上鑒定海馬的種類主要依靠背鰭和胸鰭的數(shù)目進(jìn)行區(qū)分，然而由于海馬體色不透明，此法存在一定的誤差和不便。針對(duì)這一問(wèn)題，筆者建立并且優(yōu)化了一套海馬透明化骨骼染色觀察背鰭和胸鰭數(shù)目的方法，能夠準(zhǔn)確進(jìn)行數(shù)目的鑒定。這種骨骼染色的方法不僅能應(yīng)用于海馬的種類鑒定，還可以應(yīng)用于新型海馬標(biāo)本的制備，具有科學(xué)和觀賞價(jià)值。

海馬是刺魚目海龍科海馬屬魚類的統(tǒng)稱，在我國(guó)有悠久的藥用歷史，是常用的名貴中藥材，也是水族觀賞品種。海馬具有明顯的馬頭蛇尾瓦楞身的形態(tài)特征，而且與常見(jiàn)的海洋生物不同，性成熟的雄性海馬具有育兒袋，而雌性海馬沒(méi)有，屬于雄性育兒。目前，全世界海馬約有33種，在我國(guó)近海，常見(jiàn)的海馬品種主要有大海馬（Hippocampus k e l l o g g i）、刺海馬（Hippocampus histrix）、三斑海馬（Hippocampus trimaculatus）、線紋海馬（Hippocampus erectus）、管海馬（H ippocampus k u d a）、日本海馬（Hippocampus mohnikei）等。對(duì)不同的海馬進(jìn)行種類鑒定主要依據(jù)其體長(zhǎng)、體色、吻長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)與頭長(zhǎng)的比例、背鰭和胸鰭的數(shù)目、軀干環(huán)和尾環(huán)的數(shù)目、眼棘、鼻棘和臉棘的數(shù)目、頭冠和棘的特點(diǎn)及有無(wú)斑點(diǎn)等特點(diǎn)來(lái)區(qū)分。這些鑒定方法主要是對(duì)海馬外觀進(jìn)行形態(tài)觀察，但是在操作過(guò)程中，由于海馬體色不透明且背鰭無(wú)法伸展開，無(wú)法很好地進(jìn)行觀察。筆者利用人工養(yǎng)殖的海馬，探索出一套海馬透明化骨骼染色的方法，染色后觀察背鰭和胸鰭，能夠從形態(tài)上更加精確地進(jìn)行種類鑒定。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

海馬取自福建省水產(chǎn)研究所小嶝島實(shí)驗(yàn)基地，品種有大海馬、刺海馬、線紋海馬、膨腹海馬和日本海馬。

（二）試驗(yàn)方法

1.固定：將整只海馬在4%PFA溶液固定24小時(shí)，期間保持海馬浸沒(méi)在固定液中并在搖床上不斷搖動(dòng)。

2.脫水：除去4%PFA溶液，采用3種方法進(jìn)行脫水，第一種是直接用不同濃度的丙酮（30%、50%、70%、90%和100%）浸泡脫水，每個(gè)梯度丙酮浸泡12小時(shí)；第二種是先用不同濃度的乙醇（30%、50%、70%、90%和100%）浸泡脫水，每個(gè)梯度乙醇浸泡12小時(shí)，之后倒去乙醇，用100%丙酮浸泡脫水24小時(shí)。第三種是直接用100%丙酮浸泡96小時(shí)脫水。脫水期間保持海馬浸沒(méi)在脫水液中，并在搖床上緩慢不斷搖動(dòng)。操作丙酮時(shí)要在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。

3.染色：倒去丙酮溶液，用染色劑染色5天，染色劑配制方法為1體積的0.1%茜素紅（溶于95%乙醇）+1體積的0.3%阿利新藍(lán)（溶于70%乙醇）+1體積的100%乙酸+17體積的100%乙醇。

4.脫色：倒去染色液，將海馬移入2%的KOH溶液中進(jìn)行脫色4天。

5.透明：倒去KOH溶液，用不同濃度的甘油（30%、50%、70%、90%和100%）浸泡透明，每個(gè)梯度甘油浸泡24小時(shí)。

6.拍照：用體視顯微鏡進(jìn)行背鰭數(shù)目的觀察。

二、結(jié)果

（一）海馬透明化骨骼染色不同脫水方案的比較

在海馬的骨骼染色方法中，比較不同的脫水方法的染色結(jié)果，如圖1所示，第一種濃度梯度丙酮脫水和第二種濃度梯度乙醇和丙酮脫水的方法均能夠獲得很好的染色效果，而第三種丙酮直接脫水法，在染色效果中呈現(xiàn)局部染色不均勻的結(jié)果?？梢?jiàn)，第一種和第二種脫水方法滿足染色要求?？紤]到丙酮屬于有毒有機(jī)溶劑，第二種脫水方法比第一種更能節(jié)省丙酮溶劑的使用量，因此確定第二種濃度梯度乙醇和丙酮脫水方法為更優(yōu)的脫水方法。

（二）海馬背鰭和胸鰭數(shù)目的觀察

利用優(yōu)化好的方法對(duì)線紋海馬進(jìn)行骨骼染色觀察，并且詳細(xì)記錄海馬胸鰭和背鰭的數(shù)目，結(jié)果如圖2B、C、D所示，分別為17和18。而不通過(guò)骨骼染色，直接對(duì)海馬進(jìn)行背鰭計(jì)數(shù)圖片如圖2A所示，無(wú)法進(jìn)行有效觀察。

圖2 線紋海馬的骨骼染色觀察

表1 不同品種海馬背鰭和胸鰭數(shù)目觀察

（三）不同種海馬的骨骼染色觀察方法

收集大海馬、刺海馬、線紋海馬和膨腹海馬四種海馬進(jìn)行整骨染色，觀察背鰭和胸鰭。結(jié)果如表1所示。對(duì)比文獻(xiàn)報(bào)道的各種海馬背鰭數(shù)和胸鰭數(shù)，與觀察到結(jié)果基本一致。

三、小結(jié)與討論

在海馬個(gè)體透明化骨骼染色過(guò)程中，脫水是一個(gè)關(guān)鍵的步驟，直接影響后續(xù)的染色效果。乙醇和丙酮能夠?qū)⒑ｑR組織中的水分置換出來(lái)，使得染料更容易進(jìn)入到海馬組織中。乙醇是常用的組織脫水劑，脫水能力很強(qiáng)，但容易使組織收縮變脆，尤其是100%乙醇更甚。因此在使用乙醇脫水時(shí)，需要從低濃度向高濃度進(jìn)行。跟乙醇相比，丙酮的組織穿透性和脫水性更強(qiáng)，同時(shí)丙酮還有脂溶性，能去除組織內(nèi)的脂肪，但是對(duì)組織有劇烈的收縮作用，使用的時(shí)候也是必須從低濃度向高濃度進(jìn)行。此外，丙酮屬于有毒的試劑，而且價(jià)格比乙醇貴，考慮效果和成本，認(rèn)為第二種梯度乙醇和丙酮相結(jié)合的脫水方法是更優(yōu)的方法。

海馬常見(jiàn)的分類標(biāo)準(zhǔn)之一是背鰭和胸鰭的數(shù)目，主要是在體式顯微鏡下剝離背鰭和胸鰭進(jìn)行計(jì)數(shù)，但是這種方法不易操作。將海馬進(jìn)行骨骼染色后再進(jìn)行觀察背鰭和胸鰭數(shù)，可以很精確地對(duì)海馬背鰭和胸鰭進(jìn)行計(jì)數(shù)。

海馬標(biāo)本經(jīng)過(guò)骨骼染色后，可以在甘油中長(zhǎng)期保存以供實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科學(xué)研究使用，同時(shí)經(jīng)過(guò)染色的海馬標(biāo)本色彩鮮艷，可以做為特色工藝品銷售，可以對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中意外死亡的海馬進(jìn)行再次利用開發(fā)。同時(shí)這種染色的方法還可以應(yīng)用于幼魚中，觀察幼魚的背鰭和胸鰭以及椎骨數(shù)目進(jìn)行種類鑒定。