HPLC同時測定六味葛藍(lán)降脂片中葛根素、大豆苷元、橙黃決明素和大黃酚的含量

肖明 周雅琪 李芳嬋

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法同時測定六味葛藍(lán)降脂片中的葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的含量。 方法 采用高效液相色譜法，色譜柱Phenomenex Gemini C18（250 nm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長為285 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min。 結(jié)果 葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚進(jìn)樣量分別在0.01 458～0.06 562 mg/mL、0.1074～0.2417 mg/mL、0.014 58～0.065 62 mg/mL、0.012 01～0.054 04 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.995 94、0.999 95、0.999 97、0.991 57）；平均加樣回收率分別為99.0%、102.9%、104.1%、104.1%，RSD分別為0.390%、0.910%、0.050%、0.057%（n = 6）。 結(jié)論 本方法簡便、準(zhǔn)確，方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于六味葛藍(lán)降脂片的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜；六味葛藍(lán)降脂片；葛根素；大豆苷元；橙黃決明素；大黃酚

[中圖分類號] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（c）-0105-05

Simultaneous determination of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol in Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets by HPLC

XIAO Ming1 ZHOU Yaqi2 LI Fangchan3 JIANG Lin3 WEI Bowei2

1.Health Food Branch of Guangxi Zhuang Yao Pharmaceutical Engineering Technology Research Center， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2.Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China； 3.School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol in Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets. Methods High performance liquid chromatography method was used. Phenomenex Gemini C18 （250 nm × 4.6 mm， 5 um） was used as the chromatographic column. The mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution. The gradient elution method was used. The detection wavelength was 285 nm， the column temperature was 30℃， and the flow rate was 1.0 mL/min. Results The injection quantities of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol showed good linear relationship with peak area in the range of 0.014 58-0.065 62 mg/mL， 0.1074-0.2417 mg/mL， 0.014 58-0.065 62 mg/mL， 0.012 01-0.054 04 mg/mL （r = 0.995 94， 0.999 95， 0.999 97， 0.991 57）， respectively， and the average recovery rates were 99.0%， 102.9%， 104.1%， 104.1%， and RSD were 0.390%， 0.910%， 0.050%， 0.057% （n = 6）， respectively. Conclusion The method is simple， accurate， stable and reproducible. It can be used for the quality control of Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets.

[Key words] High performance liquid chromatography； Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets； Puerarin； Daidzein； Aurantio-obtusin； Chrysophanol

近年來，高脂血癥發(fā)病率呈明顯增高和年輕化的趨勢，在飲食控制的基礎(chǔ)上使用保健食品調(diào)整血脂水平，對防治心腦血管疾病具有重要意義[1-4]。六味葛藍(lán)降脂片是由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠開發(fā)的具有輔助降血脂功效的產(chǎn)品，其由絞股藍(lán)、火麻仁、決明子、葛根、沙棘和荷葉六味藥食同源藥材配伍而成。原標(biāo)準(zhǔn)僅以單指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制，難以控制中藥復(fù)方的整體質(zhì)量[5]。方中主藥決明子和葛根具有降血脂和改善心腦血管循環(huán)等作用[6-8]。其中決明子的降血脂代表性成分有大黃酚和橙黃決明素[9-11]。葛根降血脂的代表性成分有葛根素、大豆苷元[12-15]。本研究采用高效液相色譜法對六味葛藍(lán)降脂片中橙黃決明素、大黃酚、葛根素和大豆苷元4種藥效成分進(jìn)行含量測定，建立控制指標(biāo)，以期為全面考察六味葛藍(lán)降脂片內(nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1260高效液相色譜儀、Alltech1260-UV型紫外檢測器、KQ5200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、SQP型電子天平[百萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 試藥

葛根素對照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：170109，純度為>98%）、大豆苷元對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17101202，純度為99.99%）、橙黃決明素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111900-201303，純度為99.1%）、大黃酚對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17041310，純度為99.50%）。甲醇、乙醇、磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）。

六味葛藍(lán)降脂片樣品（規(guī)格：2 g/片，批號：20170501、20170601、20170602、20170603、20170701、20170801、20170802、20170803、20170901、20171001）均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速：1 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：15 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品制備 精密稱取葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚對照品適量，以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為葛根素1.027 mg/mL、大豆苷元1.030 mg/mL、橙黃決明素1.045 mg/mL及大黃酚1.102 mg/mL的混合對照儲備液；另取上述溶液適量，置于同一量瓶中，加甲醇制成含葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚濃度分別為0.1535、0.03413、0.05104、0.04203 mg/mL混合對照品溶液，避光冷藏保存。

2.2.2 供試品溶液制備 取重量差異項下的六味葛藍(lán)降脂片20片，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，搖勻，過濾，揮干，用適量95%乙醇溶解并定容置5 mL容量瓶，搖勻，過濾，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心10 min，取濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按六味葛藍(lán)降脂片處方比例稱取缺葛根和決明子的藥材，分別按處方工藝提取，再按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3專屬性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對照品色譜中與樣品色譜在相同保留時間處都有色譜峰，而陰性対照液中無相應(yīng)峰，提示樣品中其他成分對葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚成分的測定無干擾，理論塔板數(shù)均>5000，拖尾因子均在0.95～1.05，分離度均>1.5。見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密取上述混合對照品溶液適量，分別配成葛根素濃度為0.043 87、0.087 74、0.1316、0.1535、0.1755、0.1974 mg/mL，大豆苷元濃度為0.009 750、0.019 50、0.024 38、0.034 13、0.039 01、0.043 88 mg/mL，橙黃決明素濃度為0.014 58、0.029 17、0.043 75、0.058 33、0.065 62 mg/mL，大黃酚濃度為0.012 01、0.024 02、0.036 03、0.042 03、0.048 04、0.054 04 mg/mL的溶液；按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。

2.5 中間精密度試驗

取上述混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的峰面積，其RSD分別為1.30%、0.99%、0.99%、0.66%。提示儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取六味葛藍(lán)降脂片樣品（批號：20170801）適量，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算RSD。葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的RSD分別為1.90%、0.52%、1.80%和2.10%。提示供試品溶液中的4個成分在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取六味葛藍(lán)降脂片樣品（批號：20170801），平行6份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算。結(jié)果6份樣品中葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的平均含量分別為0.7975 mg/g、0.1608 mg/g、0.2342 mg/g、0.1721 mg/g，RSD分別為3.7%、2.5%、2.9%、3.1%。提示本法重復(fù)性較好。

2.8加樣回收率

取同一批含量已知的六味葛藍(lán)降脂片樣品（批號：20170801）粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入葛根素、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚對照品0.3260、0.0724、0.0996、0.0860 mg，按“2.2.2”項下供試品溶液制備，并按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果葛根素、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚的平均加樣回收率分別為99.0%、102.9%、104.1%、104.1%。提示該方法準(zhǔn)確性較好。見表3。

2.9 樣品含量測定

取10批六味葛藍(lán)降脂片樣品粉未，平行3份，按照“2.2.2”項下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算葛根素、大豆苷元、橙黃決明素和大黃酚的含量。綜合原藥材來源差異，擬制訂葛根素、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚含量限度分別不少于0.8702、0.1920、0.2938、0.2188 mg/片。見表4。

3 討論

10批六味葛藍(lán)降脂片中葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的含量均存在一定差異。通過分析，認(rèn)為可能是由于不同批次六味葛藍(lán)降脂片的原藥材產(chǎn)地不同，其成分含量不同所致。為更好地控制該制劑含量，應(yīng)從藥材源頭開始，并在整個生產(chǎn)過程中嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制，才能更好地保證制劑的質(zhì)量。本研究建立的高效液相色譜法可同時測定制劑中多個不同指標(biāo)成分，該方法簡單快速、準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好。與原標(biāo)準(zhǔn)[5]比較，具有分離效果好、簡單快速的測定多種成分的優(yōu)點，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。決明子和葛根為六味葛藍(lán)降脂片中輔助降血脂功效的重要組成，決明子中的大黃酚和橙黃決明素為降血脂的主要活性成分，可以作為六味葛藍(lán)降脂片的質(zhì)量標(biāo)志物之一[16-17]。葛根中的葛根素能降低血清總膽固醇，調(diào)節(jié)膽固醇血癥患者的血脂水平，是葛根降血脂的重要活性成分[18-19]。大豆苷元對心血管具有保護(hù)作用，可以作為產(chǎn)品質(zhì)量控制指標(biāo)[20-21]。本研究選擇葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚4種成分作為指標(biāo)成分對六味葛藍(lán)降脂片進(jìn)行質(zhì)量控制，為六味葛藍(lán)降脂片的研制與開發(fā)提供了理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 農(nóng)毅清.藥食兩用中藥降血脂活性成分的研究概況[J].廣西中醫(yī)藥，2016，39（1）：4-7.

[2] 食品市場資訊.美、日心血管類保健食品現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].中國食品學(xué)報，2007，7（4）：119.

[3] 楊勇，闞健全，趙國華，等.血管內(nèi)皮功能與調(diào)節(jié)心血管功能保健食品的功能評價[J].食品科學(xué)，2004，25（8）：173-176.

[4] 錢勇.保健食品領(lǐng)跑降脂降糖產(chǎn)品市場[N].醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，3（C19）：1-2.

[5] 農(nóng)毅清，蔣林，羅宇東，等.六味葛藍(lán)降脂片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].食品與藥品，2016，18（3）：170-174.

[6] 何菊英，劉松青，彭永富，等.決明子降血脂作用機(jī)制研究[J].中國藥房，2003，14（4）：10-12.

[7] 趙淑芹.葛根的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（2）：40-43.

[8] 王青，張偉東，宋小妹，等.HPLC法同時測定不同產(chǎn)地決明子中12種蒽醌類成分的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2012，28（6）：502-505.

[9] 馮艷平.決明子降血脂有效成分探討[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11（5）：258-259.

[10] 黃小平，鐘國躍，張雪梅，等.HPLC法測定決明子中大黃酚和橙黃決明素[J].中國中藥雜志，2010，35（16）：2065-2067.

[11] 崔蘇鎮(zhèn)，彭學(xué)蓮.葛根的藥理作用研究概況[J].時珍國醫(yī)國藥，1998，9（3）：90-91.

[12] Song W，Li Y，Qiao X，et al. Chemistry of the Chinese herbal medicine Puerariae Radix（Ge-Gen）：A review [J]. Chin Pharm Sci，2014，23（6）：347-360.

[13] 姚丹，丁選勝.葛根素藥理作用機(jī)制探討及臨床應(yīng)用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008，13（4）：468-474.

[14] 尹麗紅，李艷楓，孟繁琳，等.葛根的化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用[J].黑龍江醫(yī)藥，2010，23（3）：371-373.

[15] 鄭高利.大豆異黃酮的藥理作用Ⅰ[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1998，15（1）：4-5.

[16] 何菊英，劉松青，彭永富，等.決明子降血脂作用機(jī)制研究[J].中國藥房，2003，14（4）：10-12.

[17] 李明元，羅孟軍，葉娉，等.橙黃決明素的降血脂作用研究[J].中藥藥理與臨床，2008，24（6）：36-37.

[18] 沈奇桂，朱壽民.決明子對實驗性高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的抑制作用及其機(jī)理探討[J].浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1993，22（6）：246-249.

[19] 石勇，吳正奇.葛根和葛根保健品的國內(nèi)外研究進(jìn)展[J].湖北工學(xué)院學(xué)報，2000，15（1）：52-55.

[20] 李和偉，趙彤，董玲，等.口服葛根的腸代謝特征分析[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2014，36（2）：131-134.

[21] Choo MK，Park EK，Yoon HK，et al. Antithrombotic and antiallergic activities of daidzein，a metabolite of puerarin and daidzin produced by human intestinal microflora [J]. Biol Pharm Bull，2002，25（10）：1328.

（收稿日期：2018-05-30 本文編輯：王 蕾）