BDNF在APP/PS1轉基因小鼠皮層和海馬內的表達及其對學習記憶能力的影響*

郝繼偉，李鶯歌，王 來，耿慧霞△

(河南大學1護理與健康學院，2生命科學學院，河南 開封 475001)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種中樞神經慢性退行性疾病，其典型的神經病理學變化為大腦內出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉淀形成老年斑和神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)，從而致使神經元大量凋亡，導致患者記憶能力的降低和認知、情感的障礙[1]。APP/PS1雙轉基因小鼠大腦神經元內轉入突變的淀粉樣前體蛋白(APPswe)和早老素(ΔE9)基因，從而使該小鼠的大腦內在3月齡時即可檢測出Aβ斑，因此，常作為研究AD的一種動物模型[2]。

腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)屬于神經營養(yǎng)因子家族成員之一，廣泛表達在皮層、海馬、杏仁核和小腦等腦區(qū)，參與神經元的發(fā)育、生長、軸突出芽和樹突棘形成等神經元的成熟過程，影響著神經元與神經元之間突觸的可塑性和學習記憶能力的形成等高級神經生物學過程[3]。AD患者的臨床檢測顯示大腦內BDNF的表達減少，然而對多種AD動物模型的研究表明，腦內BDNF表達水平的變化出現(xiàn)差異，如APPswe和APPswe/PS1-P264L模型小鼠的BDNF在mRNA水平降低，而APPswe/PS1-M146V 模型小鼠沒有發(fā)生該類改變；APPswe/PS1/tau模型小鼠腦內BDNF在蛋白質水平表達降低，而另外的研究顯示該蛋白的表達水平升高[4]。為進一步明確AD動物模型APP/PS1雙轉基因小鼠腦內BDNF的表達變化以及對學習記憶能力的影響，本研究以APP/PS1雙轉基因小鼠作為研究對象，利用剛果紅染色、TUNEL試劑盒、免疫熒光、Western blot技術和Morris水迷宮方法分別檢測大腦皮層和海馬區(qū)淀粉樣蛋白Aβ斑的沉積，神經元細胞凋亡，BDNF的表達以及空間學習記憶能力，從而深入探究BDNF在野生型小鼠和APP/PS1雙轉基因小鼠大腦皮層和海馬內的表達變化以及對學習記憶能力的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

C57BL/6小鼠和APP/PS1雙轉基因小鼠購于南京大學模式動物研究所[許可證號：SCXK(蘇)2001-0001]，并在本實驗室飼養(yǎng)繁育。APP/PS1雙轉基因雄鼠與野生型雌鼠合籠繁殖，幼鼠2周后，做基因型鑒定，選取6月齡和12月齡的雌雄APP/PS1轉基因鼠和野生型小鼠作為研究對象。在保證供水、飼料充足的前提下，按自然晝夜節(jié)律，室溫22～25 ℃、相對濕度60%～80%的環(huán)境下飼養(yǎng)。

2 主要試劑

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Promega；DAPI試劑和剛果紅染色試劑盒購自索萊寶公司；兔抗BDNF多克隆抗體(ab108319)和鼠抗β-actin多克隆抗體(ab8226)購自Abcam；2×PCR Mix和RIPA裂解液購自康為世紀生物有限公司；增強型ECL發(fā)光試劑盒購自Millipore；Alexa Fluor 488標記的熒光 II 抗和BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher；HRP標記的 II 抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司；其它試劑均為國產分析純。

3 實驗方法

3.1石蠟切片 選取適宜月齡的APP/PS1雙轉基因和C57BL/6野生型小鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，預冷PBS經心臟灌流，直至灌流液清亮為止，隨后用4%的多聚甲醛緩緩進行灌注固定。將固定后的小鼠用剪刀從頸部剪開取出完整大腦，并置于4%多聚甲醛中室溫浸泡固定24 h，然后用PBS漂洗3次。對固定后的大腦組織塊進行修剪處理，棄小腦，分離左右半球。隨后進行脫水處理，依次在濃度為50%的乙醇浸泡2 h、70%的乙醇浸泡過夜、80%的乙醇浸泡1 h、90%的乙醇浸泡1 h、95%的乙醇Ⅰ浸泡1 h、95%的乙醇Ⅱ浸泡1 h、無水乙醇Ⅰ浸泡1 h、無水乙醇Ⅱ浸泡1 h、二甲苯Ⅰ浸泡1 h、二甲苯Ⅱ浸泡1 h，放入冬青油中過夜。提前1～2 h打開生物組織包埋機，脫水后的組織塊分別用蠟Ⅰ、蠟Ⅱ和蠟Ⅲ各處理1 h，最后用硬蠟包埋即可得到蠟塊。將蠟塊置于萊卡輪式切片機(Leica，RM2235)上切為厚度為4 μm的薄片。

3.2Aβ斑標記 將切好的組織切片鋪于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60 ℃烘箱烘干1 h，常規(guī)脫蠟至水(二甲苯Ⅰ浸泡15 min，二甲苯Ⅱ浸泡15 min、無水乙醇Ⅰ浸泡5 min、無水乙醇Ⅱ浸泡5 min、95%的乙醇Ⅰ浸泡5 min、95%的乙醇Ⅱ浸泡5 min、90%的乙醇浸泡5 min、80%的乙醇浸泡5 min、70%的乙醇浸泡5 min、50%的乙醇浸泡5 min)。入蘇木素染色液浸染5～15 min，酸性乙醇分化10～15 s，然后立即入水終止分化，自來水沖洗2 min，再用堿性NaCl溶液浸染切片，然后將切片直接放入堿性剛果紅染色液浸染(溶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用)，無水乙醇沖洗，逐級常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡(Olympus, BX61)觀察海馬和皮層區(qū)域并拍照。

3.3TUNEL檢測細胞凋亡 選取小鼠大腦石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，根據(jù)試劑盒說明書進行實驗操作。將載玻片依次浸入0.85% 的NaCl溶液5 min、PBS 5 min、4%的甲醛溶液20 min,PBS洗滌 5 min×3次，蛋白酶 K覆蓋孵育7～12 min、PBS 5 min、4%的甲醛溶液5 min、PBS 5 min、100 μL平衡緩沖液覆蓋細胞5～10 min(以上過程均在室溫下進行)。與此同時提前避光配制rTdT孵育緩沖液(每50 μL 反應體系含有平衡緩沖液45 μL+核苷混合物5 μL+rTdT酶1 μL)。吸去平衡緩沖液，然后在細胞上加上rTdT孵育緩沖液，置于濕盒內，在37 ℃孵育60 min發(fā)生加尾反應，避免光照，后將載玻片浸入2×SSC溶液，室溫放置15 min以終止反應，后將載玻片浸入新鮮的PBS中洗滌3次，每次5 min。DAPI甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察皮層和海馬區(qū)域并拍照。

3.4免疫熒光 選取石蠟切片，脫蠟至水，0.1 mol/L的 PBS浸洗3次，每次10 min,后將石蠟切片浸入檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱到92～100 ℃ 10 min(注意不能沸騰)以修復抗原，待放置恢復常溫后PBS洗3次，每次10 min,擦干切片組織周圍水分后用免疫組化筆圈起組織，加稀釋過的 I 抗(兔抗BDNF多克隆抗體，稀釋比例1∶100)，放置于濕盒內，4 ℃冰箱過夜。次日早晨，取出室溫放置30 min，PBS洗滌3次,每次10 min。擦干多余液體，注意組織不能干透，避光加稀釋過的 II 抗(稀釋比例1∶500)，室溫孵育3 h或38 ℃ 30 min，PBS洗滌3次，每次10 min,DAPI甘油封片，熒光顯微鏡(Olympus，BX61)觀察皮層和海馬區(qū)域并拍照。

3.5Western blot實驗 10%水合氯醛腹腔麻醉實驗小鼠，冰上灌流，取腦，剝離皮層和海馬，分別置于800 mL和500 mL 的RIPA裂解液中，勻漿器勻漿，4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清凍存-80 ℃?zhèn)溆?。BCA法對蛋白定量。30 μg樣品經12% SDS-PAGE分離，電流200 mA，濕法轉膜2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入 I 抗，4 ℃過夜。次日早上，用TBST漂洗3次，每次5 min,然后在含有 II 抗的孵育袋內室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，每次5 min,添加ECL發(fā)光液暗室曝片。

3.6Morris水迷宮實驗 分2個部分進行。第1部分為定位航行實驗，該實驗用于訓練和檢測小鼠的空間學習和記憶能力。每天訓練小鼠，選定水迷宮的某一象限將小鼠放入，攝像頭記錄并計算小鼠從放入點游到平臺所需的時間，即為逃避潛伏期；倘若小鼠在60 s時間內沒有游行到平臺，則引導其到平臺并停留10 s。每天如此訓練，共持續(xù)6 d。第7天開始記錄小鼠游到平臺所需的時間即為逃避潛伏期。第2部分為空間搜索實驗：在第8天時，將水下平臺撤除，將小鼠放置在訓練時的同一象限，記錄60 s內小鼠尋找平臺所耗費的時間和進入該平臺所位象限的次數(shù)，作為空間記憶的檢測指標。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)的形式表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或獨立樣品t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Aβ斑的形成

剛果紅染色標記皮層和海馬區(qū)Aβ斑變化的結果顯示，12月齡的野生型小鼠皮層和海馬CA1區(qū)都沒有見到Aβ斑的出現(xiàn)，而6月齡和12月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬CA1區(qū)都出現(xiàn)Aβ斑，且12月齡小鼠Aβ斑的數(shù)量多于6月齡小鼠(P<0.05)。對Aβ斑的形態(tài)結構和大小分析表明，12月齡小鼠皮層和海馬CA1區(qū)Aβ斑的形態(tài)明顯大于6月齡小鼠,見圖1、2。這說明隨著年歲的增加和發(fā)病時間的延長，腦內形成的Aβ斑數(shù)量增加，形態(tài)變大，因此后續(xù)實驗就采用12月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠作為研究對象。

2 神經元凋亡

APP/PS1雙轉基因小鼠和野生型小鼠皮層和海馬區(qū)神經元細胞凋亡的檢測結果顯示，12月齡APP/PS1雙轉基因小鼠TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯多于野生型小鼠(P<0.01)，見圖3、4。

3 BDNF的表達

分別采用免疫熒光和Western blot的方法檢測APP/PS1雙轉基因小鼠和野生型小鼠皮層和海馬區(qū)BDNF的表達變化。免疫熒光的結果顯示，野生型小鼠BDNF表達陽性的細胞數(shù)量多于APP/PS1雙轉基因小鼠(P<0.01),見圖5。Western blot結果顯示，野生型小鼠皮層和海馬區(qū)成熟形式的BDNF表達量明顯高于APP/PS1轉基因小鼠(P<0.01),見圖6。

Figure 1.Aβ plaques were stained with Congo red in the cerebral cortex of WT andAPP/PS1transgenic mice. A: WT mice; B: 6-month-oldAPP/PS1mice; C: 12-month-oldAPP/PS1mice; D: the quantificative analysis of Aβ plaques inAPP/PS1mice. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs6 months.

圖1 剛果紅染色標記皮層的Aβ斑

Figure 2.Aβ plaques were stained with Congo red in the hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice. A: WT mice; B: 6-month-oldAPP/PS1mice; C: 12-month-oldAPP/PS1mice; D: the quantitative analysis of Aβ plaques inAPP/PS1mice. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs6 months.

圖2 剛果紅染色標記海馬的Aβ斑

4 空間學習記憶能力

Morris水迷宮檢測結果顯示，APP/PS1雙轉基因小鼠的逃逸潛伏期長于野生型小鼠，且在空間搜索實驗中，APP/PS1雙轉基因小鼠在60 s內穿越平臺所在象限的次數(shù)也少于野生型小鼠(P<0.05或P<0.01),見圖7A、B。軌跡圖的結果表明APP/PS1雙轉基因小鼠的運行軌跡雜亂無章，而野生型小鼠運行軌跡并不雜亂，圍繞平臺尋找，規(guī)律性比較明顯,見圖7C。

討 論

隨著老齡化社會的到來，AD嚴重威脅著中老年人的身心健康。病理檢測發(fā)現(xiàn)，該病的典型病理學特點為大腦內出現(xiàn)Aβ斑聚集和神經元纖維纏結，并觀察到神經元的凋亡和軸突降解，致使患者出現(xiàn)認知功能障礙、記憶能力降低等癥狀。有研究顯示，APP/PS1雙轉基因小鼠可以作為AD研究的動物模型，最早在3月齡時即可觀測到腦內Aβ斑的形成，本研究證實，該鼠在6個月時可觀察到皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)Aβ斑，并隨病程的增長，12月齡時，Aβ斑的數(shù)量和形態(tài)都呈進行性增加，說明隨著年歲的增加，該小鼠AD的神經病理學變化更加明顯，符合臨床上年齡越大該病發(fā)病率越高、癥狀越嚴重的特點。伴隨Aβ斑形成，出現(xiàn)的是神經元凋亡的數(shù)量發(fā)生相應的變化，如12月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬區(qū)神經元細胞凋亡的數(shù)量與野生型相比急劇增加。對小鼠空間學習記憶能力的檢測也表明，12月齡APP/PS1雙轉基因小鼠的空間學習記憶能力受到嚴重損傷，如逃逸潛伏期所耗時長遠遠大于野生型小鼠，在60 s內穿越平臺所位象限的次數(shù)也少于野生型小鼠，且在Morris水迷宮實驗中的游泳軌跡雜亂無章，沒有規(guī)律可循。這些變化與AD患者出現(xiàn)Aβ斑聚集的病理變化和病程增加出現(xiàn)認知、記憶功能障礙的臨床表現(xiàn)相一致，表明該轉基因小鼠可以作為研究AD發(fā)病機制的一種理想動物模型。

Figure 3.Apoptosis in the cerebral cortex of WT andAPP/PS1transgenic mice was detected by TUNEL assay. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖3 野生型和APP/PS1轉基因小鼠皮層細胞凋亡情況的比較

Figure 4.Apoptosis in the hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice was detected by TUNEL assay. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖4 野生型和APP/PS1轉基因小鼠海馬區(qū)細胞凋亡情況的比較

Figure 5.BDNF positive cells were detected by immunofluorescence staining in cerebral cortex and hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖5 免疫熒光檢測皮層和海馬區(qū)BDNF表達陽性的細胞數(shù)

Figure 6.BDNF expression was detected by Western blot in the cerebral cortex and hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖6 Western blot檢測皮層和海馬區(qū)BDNF的表達

Figure 7.The changes of learning and memory abilities of WT andAPP/PS1transgenic mice. A: the escape latency; B: the times across the platform quadrant in 60 s; C: the swim-tracking path. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖7 野生型與APP/PS1轉基因小鼠學習記憶能力的變化

BDNF最早由德國神經化學家Barde從豬的大腦中分離并克隆[5],其基因在人類定位于第11號染色體短臂1 區(qū)3 帶(11p13)，而在鼠類定位于第12號染色體上。BDNF基因編碼的多肽鏈為前體BDNF(proBDNF)，相對分子質量約為32 kD，經過胞內的絲氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶切除N端的信號肽等翻譯后修飾過程，從而形成相對分子量為13 kD的具有生物學活性的成熟形式BDNF(active BDNF)[6-7]。成熟形式的BDNF與酪氨酸蛋白激酶受體TrkB結合發(fā)揮其促進神經元分化、發(fā)育、存活、軸突出芽、樹突棘形成、突觸可塑性以及學習記憶的形成和維持等神經生物學功能[8]。本研究證實，BDNF陽性表達的細胞數(shù)量在12月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬區(qū)與野生型相比明顯減少，并且成熟形式的BDNF表達也隨著減少，表明BDNF在大腦的表達量降低參與了APP/PS1轉基因小鼠產生AD的病理變化及臨床表現(xiàn)，如神經元細胞凋亡增加和學習記憶能力降低。

BDNF在神經系統(tǒng)內的重要作用促使研究人員關注其參與中樞神經系統(tǒng)疾病的病理機制和治療潛力，對AD患者的大腦標本檢測表明，BDNF在mRNA和蛋白質表達水平都出現(xiàn)降低，且這種減低在AD患者出現(xiàn)輕度認知障礙階段就已發(fā)生，說明BDNF在大腦內表達水平的降低確實導致AD記憶能力降低等臨床癥狀的出現(xiàn)[4]。BDNF基因的單核苷酸多態(tài)性(Val66Met，rs6265)影響該蛋白在細胞內的轉導和分泌，也參與AD的發(fā)病病理機制，尤其是Met攜帶者具有更嚴重的Aβ斑聚集和認知功能障礙[9-10]。其它研究證明，增強或促進腦內BDNF的表達可以改善其他中樞神經系統(tǒng)疾病的病理改變和臨床癥狀，如腦內高的BDNF水平抑制抑郁癥小鼠海馬區(qū)神經元的凋亡，減輕抑郁癥癥狀，從而發(fā)揮神經保護作用[11-12]。本研究顯示，12月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬區(qū)成熟形式BDNF的表達下降，并出現(xiàn)神經元凋亡增加，導致小鼠空間學習記憶能力的降低。因此，調控腦內成熟BDNF的含量也許可以作為預防和治療AD的一個有效手段。