涼州區(qū)奶牛乳房炎主要病原分離鑒定及藥敏試驗

尤從彪，劉添泰，王 斐

（1.涼州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，甘肅 武威 733000；2.甘肅新天馬制藥股份有限公司，武威 733000；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070）

乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，通常由侵入乳腺及乳導管內(nèi)的病原菌引起，偶見化學性、機械性及乳房熱損傷病例。根據(jù)病理表現(xiàn)可分為漿液性乳房炎、纖維素性乳房炎、化膿性乳房炎、出血性乳房炎、壞疽性乳房炎，根據(jù)臨床觀點可分為臨床型和亞臨床性（隱性）。乳房炎是導致泌乳牛產(chǎn)奶量下降最主要的原因之一，通常會引起乳汁質(zhì)量降低［1］、泌乳減少或停止，甚至會導致慢性感染奶牛的淘汰和死亡［2-4］，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此，及時了解本地養(yǎng)殖場乳房炎的感染情況，掌握主要病原菌的耐藥情況，是畜牧獸醫(yī)監(jiān)管部門的必要工作，也是為當?shù)啬膛．a(chǎn)業(yè)保駕護航的重要措施。

目前國內(nèi)關于奶牛乳房炎主要病原菌分離鑒定及藥敏試驗的研究非常普遍，相關研究結果對乳房炎的預防、診斷及治療有著十分重要的作用。但引起奶牛乳房炎病原菌的種類和分布情況往往與地區(qū)環(huán)境有關，同時，該地區(qū)此前的用藥史也是影響病原菌耐藥性的重要因素。如果不能根據(jù)病原菌的實際耐藥性進行治療，不但可能貽誤病情、無法及時控制乳房炎，更有可能引發(fā)更為嚴重的病原菌耐藥性和獸藥殘留的問題［5］，嚴重威脅公共衛(wèi)生及奶制品食品安全。目前，尚未有甘肅省武威市涼州區(qū)奶牛養(yǎng)殖場乳房炎發(fā)病情況的調(diào)查和研究。因此，本研究對該地區(qū)的1 000頭中國荷斯坦奶牛進行了乳房炎調(diào)查、細菌學鑒定及藥敏試驗，為今后涼州區(qū)奶牛乳房炎的預防、診斷和治療及流行病學調(diào)查和主要病原菌耐藥性的研究提供可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源

甘肅省武威市涼州區(qū)5個奶牛養(yǎng)殖場共計1 000頭奶牛，年齡2～6歲，均為經(jīng)產(chǎn)母牛。

1.2 材料

蘭州奶牛隱性乳房炎診斷液（LMT）由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所提供。藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

培養(yǎng)基：0.5%綿羊全血瓊脂平板、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為北京陸橋生物有限公司產(chǎn)品；水解酪蛋白瓊脂（MH）購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 奶樣采集及LMT檢測 采集前，對奶牛乳房、乳頭及擠奶人員的手部清洗后，用酒精棉消毒。采集時，棄去前三把奶，取不同乳區(qū)奶樣，分別加入LMT檢驗皿的4個小盤內(nèi)，并傾斜檢驗皿倒出多余乳樣，每個小盤約剩余奶樣2 mL；每個小盤內(nèi)再加入LMT檢驗液2 mL，平穩(wěn)搖動檢驗皿充分混勻，約10 s后觀察混合物性狀（表1）。采集檢出結果為陽性的奶樣，置于經(jīng)高壓滅菌的10 mL離心管中，標明所采樣品的編號、日期等，冷藏并盡快運送至實驗室。

表1奶牛亞臨床性CMT標準

1.3.2 臨床型乳房炎診斷 奶牛乳房腫脹、熱、發(fā)紅；觸診時存在明顯腫塊，奶牛表現(xiàn)出明顯疼痛，對犢牛或擠奶人員有抵觸現(xiàn)象；擠奶時可見牛奶性狀發(fā)生眼觀變化，質(zhì)地稀薄，存在片狀或塊狀凝固物，混有炎性膿液，偶見鮮血（表2）。嚴重者可伴隨全身病理性變化，包括體溫升高、精神沉郁、食欲不振、反芻頻率降低等。

表2正常牛奶與臨床型乳房炎牛奶的對比

1.3.3 細菌分離純化 將采集的樣品搖勻，挑取少許接種于營養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h。取生長良好的樣品劃線接種于綿羊全血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落生長形態(tài)及溶血狀況。挑取生長特性及形態(tài)不同的單個菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。細菌菌液，分別進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，挑取鏡檢涂片無雜菌者，涂劃血斜面，37℃培養(yǎng)24 h后低溫保存。

1.3.4 細菌生化特性鑒定 根據(jù)染色鏡檢初步鑒定結果，對分離到的菌株進行如下生化試驗。

在麥康凱瓊脂平板上菌落為粉紅色、在伊紅美藍瓊脂上產(chǎn)生黑色帶金屬閃光的菌株進行如下生化試驗：V-P實驗、枸櫞酸鹽、甲基紅和吲哚實驗、三糖鐵斜面培養(yǎng)。三糖鐵發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，且符合吲哚（+/-）、甲基紅（+）、V（-）、枸櫞酸鹽發(fā)酵試驗（-）的菌種即可鑒定為大腸埃希氏菌（Escherichia coli）。

在肉湯中生長渾濁一致、鏡檢結果為葡萄球菌屬的菌株進行如下生化試驗：觸酶試驗、兔血漿凝固酶試驗、甘露醇發(fā)酵試驗。觸酶試驗陽性、凝固酶試驗陽性且在需氧和厭氧環(huán)境下甘露醇都能發(fā)酵的菌種即可鑒定為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

在血瓊脂平板上菌落較小、溶血，且鏡檢成不同程度鏈狀的菌株（鏈球菌屬，Streptococcus spp.）進行如下生化試驗：CAMP試驗、七葉苷水解試驗、馬尿酸鈉水解試驗和6.5%NaCl肉湯生長試驗。根據(jù)試驗結果區(qū)分無乳鏈球菌（Str.agalactiae）、停乳鏈球菌（Str.dysgalactiae）、乳房鏈球菌（Str.uberis）和糞鏈球菌（又名糞腸球菌，Enterococcus faecalis）（表 3）。

表3病原鏈球菌生化特性

1.3.5 藥物敏感性檢測（紙片擴散法） 對分離出的主要病原菌按不同屬分別進行藥物敏感性檢測。采用紙片擴散法（Kirby-Bauer法）［6］：將分離純化的細菌接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24 h；用生理鹽水稀釋至與標準比濁管濁度相當；接種于MH瓊脂平板上，每個平板上放置5個藥敏紙片；每個菌種設置3個重復；37℃培養(yǎng)18～20 h后測定細菌抑菌環(huán)的直徑。根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的標準，判定病原菌對藥物的敏感性（表3）。

藥敏紙片：青霉素（penicillin，Pen），氨芐西林（ampicillin，Amp），頭孢唑林（cefazolin，Caf），慶大霉素（gentamicin，Gen），鏈霉素（streptomycin，Str），諾氟沙星（norfloxacin，Nof），氧氟沙星（ofloxacin，Ofl），復方新諾明（SMZ-TMP），氯霉素（chloramphenicol，Chl），紅霉素（erythrocin，Ery），四環(huán)素（tetracycline，Tet），卡那霉素（kanamycin，Kan）。

表4 CLSI藥敏紙片法結果判斷標準mm

2 結果與分析

2.1 奶牛乳房炎發(fā)病情況

共檢測武威市涼州區(qū)1 000頭奶牛3 991份奶樣，其中CMT陽性奶樣1 456份，來自365頭奶牛，奶牛亞臨床性乳房炎發(fā)病率36.50%；臨床型乳房炎奶樣728份，來自182頭奶牛，奶牛臨床型乳房炎發(fā)病率18.20%；總感染率54.70%，陽性乳區(qū)率54.72%（表5）。

表5涼州區(qū)部分養(yǎng)殖場奶牛乳房炎發(fā)病率

2.2 主要病原菌分離鑒定

分別取臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎奶樣各400份，分離純化病原菌。其中655份奶樣中只分離出一種病原菌，69份奶樣中分離出兩種病原菌；分離出3種及3種以上病原菌的奶樣棄之。

不同類型乳房炎奶樣中分離出的主要病原菌均為金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌及鏈球菌屬細菌，但各自占比不同。在臨床型乳房炎奶樣中共分離得到412株病原菌，以鏈球菌屬最多，共224株（54.37%），金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌分別為121株（29.37%）和49株（11.89%）；而亞臨床型乳房炎奶樣中共分離得到381株病原菌，其中金黃色葡萄球菌最多，共185株（48.56%），鏈球菌屬次之，共84株（22.05%），大腸埃希氏菌依然最少，共71株（18.64%）（表6）。

表6涼州區(qū)部分養(yǎng)殖場奶牛乳房炎主要病原菌

通過生化試驗共分離鑒定出無乳鏈球菌161株、停乳鏈球菌80株、乳房鏈球菌132株、糞鏈球菌27株、其他鏈球菌9株。同樣，在不同類型乳房炎奶樣中鏈球菌的分布也不相同（表7）。

2.3 藥敏試驗

共對308株鏈球菌、306株金黃色葡萄球菌和120株大腸埃希氏菌分別進行了藥敏試驗。因分離所得鏈球菌均為β溶血型，故合并進行藥敏試驗。結果顯示：鏈球菌對青霉素、氨芐西林、紅霉素和四環(huán)素耐藥性較強，對氧氟沙星和氯霉素較敏感；金黃色葡萄球菌對青霉素、四環(huán)素、紅霉素耐藥性較強，對復方新諾明耐藥性較弱，對諾氟沙星、氧氟沙星、慶大霉素較敏感；大腸埃希氏菌對四環(huán)素、鏈霉素、氨芐西林、頭孢唑林、復方新諾明有一定的耐藥性，對慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素敏感（表8）。其中，部分菌種表現(xiàn)多重耐藥性（表9）。

表7不同乳房炎中的鏈球菌分布情況

表8涼州區(qū)部分養(yǎng)殖場奶牛乳房炎主要病原菌藥敏試驗

表9分離病原菌的多重耐藥性

3 討論

奶牛乳房炎是由物理、化學或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引發(fā)的一種炎癥反應，多種病原微生物的感染是引起奶牛乳房炎的主要病因，其中主要的病原菌是大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌等［7-9］。該病廣泛存在于世界各地，發(fā)生率一直相當高［10-12］。它不僅僅給世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，也給乳品工業(yè)的發(fā)展、公共衛(wèi)生以及食品安全帶來一定隱患。本次對涼州區(qū)1 000頭泌乳奶牛乳房炎的流行病學進行了調(diào)查，結果表明，臨床型乳房炎發(fā)病率18.20%，亞臨床型乳房炎發(fā)病率36.50%，奶牛陽性率54.70%，乳區(qū)陽性率54.72%，與其他地區(qū)乳房炎的流行趨勢基本一致［13-15］。但主要病原菌的流行情況略有差異，其他部分地區(qū)以鏈球菌屬為主［16］，也有些地區(qū)以金黃色葡萄球菌為主［17-18］。本研究中，共分離出793株病原菌，其中臨床型乳房炎奶樣中以鏈球菌屬最多（54.37%），而亞臨床型中則以金黃色葡萄球菌為主（48.56%）。病原性乳房炎的發(fā)生主要與飼養(yǎng)及擠奶過程中的消毒和清潔工作有關，擠奶人員、設施及奶牛乳房消毒不徹底會導致交叉感染和二次感染。尤其是金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌，都屬于環(huán)境性病原體，在飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生狀況良好的情況下，一般不會導致疾病的發(fā)生。因此，日常的飼養(yǎng)管理中，搞好環(huán)境衛(wèi)生、注意清潔消毒對于預防和減少奶牛乳房炎的發(fā)生有著重要意義。

在耐藥性試驗中，鏈球菌和金黃色葡萄球菌都對青霉素極耐藥，耐藥率分別達到了61.04%和64.38%；此外，這兩類病原菌還對紅霉素、四環(huán)素、復方新諾明表現(xiàn)出了一定的耐藥性，尤其是金黃色葡萄球菌，對四環(huán)素的耐藥率高達40.52%。不過，鏈球菌對氧氟沙星的耐藥率極低，僅為0.97%；金黃色葡萄球菌對諾氟沙星、氧氟沙星復方新諾明耐藥性較低（＜10%），對慶大霉素、氯霉素、卡那霉素敏感。大腸埃希氏菌則對氨芐西林、頭孢唑林、鏈霉素、四環(huán)素、復方新諾明的耐藥性較強，對慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素敏感。因此，綜合3種主要病原菌的耐藥譜，建議涼州區(qū)奶牛養(yǎng)殖場在防治乳房炎時應避免使用β-內(nèi)酰胺類、紅霉素類、四環(huán)素類藥物，以免發(fā)生“藥量大、療效微”的抗生素濫用，也避免進一步增強該地區(qū)乳房炎主要病原菌的耐藥性，同時減少不合理使用抗生素帶來的奶制品內(nèi)抗生素殘留問題。推薦喹諾酮類、慶大霉素類藥物為適用藥物，及時有效地對奶牛乳房炎進行治療，切實保障涼州區(qū)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動物性食品安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)環(huán)境安全。