Xpert MTB/RIF 檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性的應(yīng)用價(jià)值研究

翁繩鳳 李寧 邢俊蓬 張長海 郭威

結(jié)核病目前仍然是嚴(yán)重危及全球的一個(gè)公共衛(wèi)生問題。近十年來，由于艾滋病的流行，移動(dòng)和流動(dòng)人口的增加，耐多藥結(jié)核桿菌的增多，以及不少國家和地區(qū)對結(jié)核病控制的忽視等因素，全球結(jié)核病形勢急劇惡化［1］。傳統(tǒng)結(jié)核診斷技術(shù)不足是造成結(jié)核不能有效被控制的原因之一，世界許多地區(qū)結(jié)核病診斷仍然依賴不敏感、容易漏診的涂片鏡檢法及耗時(shí)長的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法，從而導(dǎo)致延誤診療［2］。因此亟需新診斷技術(shù)來彌補(bǔ)這些方法的不足。近年來，由美國Cepheid 公司研發(fā)生產(chǎn)的新型的分子檢測方法-結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，Xpert MTB/RIF），逐步受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。2010年12月世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式推薦使用Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)作為一種結(jié)核病快速診斷的新方法。該方法操作簡單，快捷，全程檢測只需2 h，而傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)（Lowenstein-Jensen，LJ）需要4～8 周，時(shí)間長，無法滿足臨床需求。為了評估該技術(shù)結(jié)核病診斷效能，本研究通過對242 例臨床診斷為肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本分別采用傳統(tǒng)LJ 法和Xpert MTB/RIF 法進(jìn)行檢測，通過比對檢測的敏感度、特異度探討Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 病例來源

選取本院2016年1月至2017年7月期間住院且臨床已診斷肺結(jié)核患者242 例，其中男性182例，女性60 例，年齡范圍18～94 歲，平均（58.45±20.77）歲。病例診斷依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS288-2017 肺結(jié)核診斷［3］：臨床診斷病例在排除其他肺部疾病基礎(chǔ)上符合以下6 種情況：①胸部影像學(xué)有活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變，并具有相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。②胸部影像學(xué)有活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變，并獲得任何1 種免疫學(xué)檢查結(jié)果支持。③胸部影像學(xué)有活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變，肺外組織病理檢查證實(shí)為結(jié)核病變。④胸部影像學(xué)有活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變，和支氣管鏡檢查都符合氣管/支氣管結(jié)核。⑤符合結(jié)核性胸膜炎影像學(xué)改變，胸水為滲出液，腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）高，并獲得任何1 種免疫學(xué)檢查結(jié)果支持。⑥兒童具有肺結(jié)核臨床表現(xiàn)，符合結(jié)核病影像學(xué)改變，并獲得結(jié)核菌素試驗(yàn)或γ-干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果支持。對照組選取排除結(jié)核病以外的其他呼吸道疾病患者30 例，其中肺癌8 例，細(xì)菌性肺炎10 例，慢性阻塞性肺病9 例，支氣管擴(kuò)張3 例，疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》［4］。

1.2 儀器與試劑

Gene Xpert MTB/RIF 檢測儀及試劑盒購自美國Cepheid 公司；改良羅氏培養(yǎng)基、藥敏培養(yǎng)基及抗酸染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)

采用4%氫氧化鈉處理法，用無菌操作方法將標(biāo)本接種于改良羅氏培養(yǎng)基的斜面上，37℃，含5%～10% CO2溫箱培養(yǎng)8 周。分別在培養(yǎng)第3 天和第7 天各觀察一次，此后每周觀察一次生長情況并記錄。陽性結(jié)果隨時(shí)報(bào)告。培養(yǎng)56 天后無生長判斷為陰性結(jié)果。培養(yǎng)基上一旦出現(xiàn)菌落即進(jìn)行抗酸染色確認(rèn)是抗酸桿菌，然后進(jìn)行菌種鑒定及藥敏。所有操作參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［5］進(jìn)行。藥敏試驗(yàn)采用羅氏比例法：培養(yǎng)陽性者做藥敏試驗(yàn)，參照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》［6］，質(zhì)控菌株為H37RV，來自北京市結(jié)核病防治所。

1.3.2 Xpert MTB/RIF 檢測

每份樣本需收集至少1 mL 痰液，在處理前采集好的痰標(biāo)本需存放在2℃～8℃。根據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［5］的操作方法進(jìn)行痰樣本處理。將前處理管在漩渦振蕩器上震蕩20 s 直至無可見塊狀痰標(biāo)本存在。取2 mL 處理后樣本由加樣孔緩慢加入Cartridge 反應(yīng)盒內(nèi)，將反應(yīng)盒放入Gene Xpert 檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，2 h 后系統(tǒng)自動(dòng)顯示MTB 和RIF 檢測結(jié)果。MTB 陽性的診斷標(biāo)準(zhǔn)為5個(gè)探針中至少2 個(gè)探針Ct 值≤38，并可進(jìn)一步按照Ct 值對樣本中MTB 進(jìn)行半定量分析，Ct 值＜16 為髙荷菌量，16～22 為中等荷菌量，22～28 為低荷菌量，＞28 為極低荷菌量［7］。檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB 特異性分子信標(biāo)ΔCt 值，系統(tǒng)設(shè)置的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為［7］：ΔCt＞3.5 提示對利福平耐藥，ΔCt≤3.5 提示對利福平敏感。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB/RIF 對痰標(biāo)本MTB 的檢測結(jié)果

242 例肺結(jié)核患者中，Xpert MTB/RIF 檢測MTB 敏感度為54.96%（133/242），特異度為100%（30/30）。利福平耐藥檢出率為24.06%（32/133）。見表1。

表1 Xpert MTB/RIF 對痰標(biāo)本MTB 檢測分析［（n，%）］Table 1 Sputum MTB analysis by Xpert MTB/RIF［（n，%）］

2.2 Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)與LJ 培養(yǎng)法檢測MTB 結(jié)果比對

以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 法陽性率54.96%（133/242），LJ 培養(yǎng)法陽性率40.5%（98/242）。以固體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測MTB的敏感度為86.73%（85/98），特異度為64.60%（93/144）。2 種方法陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=59.712，P=0.000），2 種方法結(jié)果符合率為73.55%（178/242）。對Xpert MTB/RIF 和固體培養(yǎng)進(jìn)行Kappa 檢驗(yàn)，K=0.751，兩者具有好的一致性。2 種方法聯(lián)合檢測，總陽性率60.33%（146/242）。見表2。

2.3 Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)與LJ 藥敏法檢測利福平耐藥結(jié)果分析

表3結(jié)果中，Xpert MTB/RIF 檢出利福平耐藥21 例，耐藥率24.71%（21/85）；LJ 法檢出利福平耐藥20 例，耐藥率23.53%（20/85）。2 種方法對利福平耐藥性的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.033，P=0.869）。2 種方法利福平耐藥性檢測符合率為98.82%（84/85）。

表2 Xpert MTB/RIF 與LJ 培養(yǎng)檢測MTB 結(jié)果對比分析Table 2 Comparison of Xpert MTB/RIF and LJ culture in detection of MTB

表3 Xpert MTB/RIF 與LJ 藥敏法檢測利福平耐藥性結(jié)果對比分析Table 3 Comparison of Xpert MTB/RIF and conventional drug susceptibility on Rifampicin

3 討論

肺結(jié)核是通過肺部感染結(jié)核分枝桿菌而導(dǎo)致的疾病，大多數(shù)結(jié)核菌存在于肺部病灶壞死組織，然后通過痰液將結(jié)核菌排除體外。所以，是否從痰液檢出結(jié)核菌通常作為依據(jù)來診斷患者是否患有結(jié)核病。目前傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)法陽性率只有30%～40%［8-11］，特異度差，各種分枝桿菌均可生長，需要結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定方可確定是否為結(jié)核分枝桿菌。抗酸染色涂片結(jié)核菌數(shù)目需＞5 000 條/mL 才能得到陽性結(jié)果［12］。而Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)在痰標(biāo)本中的檢測極限為131 CFU/mL，靈敏度遠(yuǎn)高于涂片檢測［10］并且Xpert 技術(shù)具有操作簡便，生物安全性高，檢測過程不易受干擾等特點(diǎn)［13］。

國內(nèi)報(bào)道的對Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)的評估，其研究對象大多是成年人或兒童，對老年人群該技術(shù)的應(yīng)用評估報(bào)道不多［14］。本實(shí)驗(yàn)在一家三級老年綜合醫(yī)院進(jìn)行，老年人群有其特殊性，常存在合并多種基礎(chǔ)疾病，結(jié)核癥狀不典型，咳痰困難等問題，需要更為敏感的檢測方法早期診斷。本次研究對象是臨床診斷肺結(jié)核患者，應(yīng)用Xpert MTB/RIF 檢測痰液中的MTB 及利福平耐藥性，并與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)方法進(jìn)行比對來評價(jià)它在老年綜合醫(yī)院中肺結(jié)核診斷的敏感度和特異度。

近年來國內(nèi)外對此項(xiàng)技術(shù)做了許多研究，針對不同的檢測標(biāo)本它的敏感性和特異性顯示不同差異。一項(xiàng)多中心研究結(jié)果顯示Xpert MTB/RIF診斷結(jié)核病的特異度達(dá)99.2% ，靈敏度為92.2%，對利福平是否耐藥檢測的正確率約98%［15］。HU等［16］研究顯示痰培養(yǎng)陽性患者中Xpert 的靈敏度為94.5%，特異度為99.8%。趙冰等［17］研究發(fā)現(xiàn)，以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，痰Xpert 靈敏度為58.82%，特異度為99.68%。本次研究也顯示，在臨床診斷肺結(jié)核病例中，它檢測敏感度為54.96%，高于黃建斌［18］和趙冰等［17］研究結(jié)果（48.05%和45.45%）。說明Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)在檢測不同標(biāo)本時(shí)，敏感度存在差異，但都顯示很高的特異度。但以羅氏培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測MTB 的敏感度和特異度明顯低于王怡心等學(xué)者［13］的研究，原因可能與痰的質(zhì)量有關(guān)。試驗(yàn)中大多數(shù)是老年患者，不能正確咳痰，有的標(biāo)本是口水，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果。所以，對于老年人，一次陰性結(jié)果不能排除結(jié)核病的可能，多次檢測并引導(dǎo)正確留痰才能提高陽性率。

利福平作為重要抗結(jié)核藥物，耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，并且對利福平耐藥的90%菌株同時(shí)對異煙肼耐藥，因此檢測利福平耐藥性可作為多重耐藥結(jié)核桿菌（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）的篩選標(biāo)志［19］。Boehme 等［15］研究結(jié)果顯示，與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，Xpert MTB/RIF 能夠正確判斷97.6%的利福平耐藥菌株和98.1%的利福平敏感菌株。本研究中2 種方法檢測利福平耐藥性的符合率也達(dá)到98.82%。30 例非結(jié)核患者Xpert MTB 全部陰性，提示該方法的高特異度，與其他學(xué)者［20-21］研究結(jié)果（97.5%和98.8%）相似，說明對老年人群也具有高特異性。但本研究未建立與中青年的比對，不能充分說明該技術(shù)在老年人群中的檢測特點(diǎn)。另外，2 種方法聯(lián)合檢測結(jié)核分枝桿菌提高了單一方法的靈敏度，對結(jié)核病早期診斷有更大的意義。

當(dāng)然Xpert MTB/RIF 也存在些自身的問題及局限性，比如，對痰質(zhì)量的要求，也不能區(qū)分死菌或活菌，但它作為一種快速、直接可靠、高靈敏度和特異度地檢測結(jié)核病患者以及是否對利福平耐藥的新診斷技術(shù)，可更快的幫助臨床從病原學(xué)上檢出結(jié)核病患者，提高確診率。同時(shí)該檢測設(shè)備僅需要2 個(gè)獨(dú)立區(qū)域，更多的基層實(shí)驗(yàn)室能達(dá)到這種低設(shè)施要求，有助于基層結(jié)核病患者較早的得到準(zhǔn)確的診斷，充分的治療和患者管理［22］。因此，建議在實(shí)驗(yàn)室條件不高的地區(qū)推廣使用。