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    LASP-1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與其臨床病理特征的相關(guān)性分析

    2019-05-27 06:26:46李君強(qiáng)蔣茂芬唐晶晶王敏劉春姣肖維華馬海芬
    分子診斷與治療雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:研究

    李君強(qiáng) 蔣茂芬 唐晶晶 王敏 劉春姣 肖維華 馬海芬

    肺癌發(fā)病率在世界惡性腫瘤中排名第一,死亡率也位居首位,是一個嚴(yán)重影響居民健康和生活質(zhì)量的公共衛(wèi)生問題[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最為常見類型,所占比例約為80%~85%[2-3]。手術(shù)治療是早期NSCLC 治療的首選有效手段,而治療失敗原因主要原因為晚期轉(zhuǎn)移及惡性程度較高等。曾有國內(nèi)外研究報道,腫瘤轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的生物學(xué)過程,其中細(xì)胞遷移為腫瘤轉(zhuǎn)移的首要步驟,而細(xì)胞肌動蛋白骨架重構(gòu)是細(xì)胞運(yùn)動的第一步,故認(rèn)為肌動蛋白的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有著一定的聯(lián)系[4-5]。LASP-1 蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的肌動蛋白結(jié)合蛋白和斑粘連結(jié)合蛋白支架蛋白,與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有著密不可分的關(guān)系[6]。曾有研究報道,LASP-1cDNA 最早由乳腺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的cDNA 文庫中篩選克隆而得到[7]。而在近年研究報道中證實,LASP-1cDNA 在肝癌、食管鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、胃癌及膽囊癌組織中表達(dá)異常較為多見,關(guān)于其在NSCLC 中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未明確[8]。本文旨在探討LASP-1 蛋白在NSCLC 癌組織中的表達(dá)及與其臨床病理特征的相關(guān)性,分析LASP-1 蛋白在NSCLC 發(fā)生和進(jìn)展中的作用機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料

    隨機(jī)選取2014年1月至2018年5月在本院就診的102 例NSCLC 患者作為研究對象,其中男61例,女41 例,年齡為48~80 歲,平均年齡為(58.36±5.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①所有患者均符合臨床上NSCLC 明確診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②所有患者完善準(zhǔn)備后均行手術(shù)治療且術(shù)中及術(shù)后均行病理學(xué)檢查確診;③所有患者知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在手術(shù)禁忌癥者;②除NSCLC外存在其他惡性腫瘤者;③存在原發(fā)性肝腎、功能障礙者;④臨床病例資料不完整或缺乏準(zhǔn)確性者。

    1.2 研究方法

    收取102 例NSCLC 患者中肺鱗狀細(xì)胞癌與腺癌組織共102 份(觀察組),另收集肺癌旁組織形態(tài)學(xué)正常的肺組織(距離腫瘤5 cm 以上)102 份(對照組),2 組組織標(biāo)本均采用免疫組化EnVision 法進(jìn)行LASP1 蛋白水平的檢測。

    1.2.1 檢測所需試劑/儀器

    免疫組化試劑盒(H.SABC,SAl082)購于武漢博士德生物工程有限公司;自動切片機(jī)購自德國LECIA 公司;顯微攝像儀(BX60 型)購自日本Olympus 公司;Simply P 總RNA 提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司;RT-PCR 試劑盒(批號AK2801)購自于日本TaKaRa 公司;熒光定量PCR儀(PRISM7700)購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司;LASP-1 一抗體購自上?;鄯f科技有限公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)由本醫(yī)院提供,山羊抗兔/鼠二抗購自上海睿鉑賽生物科技有限公司。

    1.3 免疫組化檢測方法

    采用Envision 法檢測:所有標(biāo)本組織石蠟切片厚度為4 μm,裱片后60℃烘烤2~4 h;二甲苯2 次及酒精梯度脫蠟至水;置切片于1.5%甲醇過氧化氫液(室溫10 min)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,將切片取出用自來水沖洗干凈,置切片于pH 值為9.0的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)(煮沸20 min,室溫冷卻20 min);將切片用自來水清洗干凈,依次入蒸餾水1 次、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)3 次;將切片放于孵育盒上滴加正常非免疫山羊血清;將血清清除后,滴加1∶600 濃度的LASP-1 一抗(來源于英國Abcam 公司)4℃孵育過夜,對照組采用PBS 代替一抗;次日取出切片置于自來水、蒸餾水1 次、PBS 3 次清洗切片;滴加山羊抗兔/鼠二抗(DAKO)室溫孵育30 min;二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木精復(fù)染,酒精梯度脫水,二甲苯透明,最后中性樹脂封片。

    1.4 資料收集與染色結(jié)果判讀

    記錄所有患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、分化程度、浸潤深度、TNM 分期系統(tǒng)(tumor node metastasis,TNM)分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和不同組織標(biāo)本中LASP-1 蛋白的表達(dá)水平,并比較不同組織中LASP-1 蛋白表達(dá)水平的差異。LASP-1 蛋白結(jié)果評定方法[10]:每個標(biāo)本隨機(jī)選取10 個高倍視野(×100)的陽性細(xì)胞百分比計算,以其平均值作為評定依據(jù)。陽性染色為淡黃色、棕褐色或棕黃色,呈團(tuán)塊狀或顆粒狀。專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分[11]:3 分為棕褐色,2 分為棕黃色,1 分為淺黃色;0 分為無色;根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評分:全陰性為0 分,陽性細(xì)胞>75%為4 分,51%~75%為3 分,11%~50%為2 分,≤10%為1分。二者評分的乘積≥2 分者則判斷為LASP1 蛋白陽性,二者評分的乘積<2 分者為陰性。將已知陽性切片作為陽性對照。

    1.5 統(tǒng)計方法

    均采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料通過率或構(gòu)成比表示,并采用χ2檢驗,以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 2 組組織標(biāo)本中LASP-1 蛋白表達(dá)情況比較

    NSCLC 患者癌組織中LASP-1 蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1;且LASP-1 蛋白在NSCLC 癌旁正常組織細(xì)胞漿中表現(xiàn)為無色,而在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌癌組織細(xì)胞器細(xì)胞漿中表現(xiàn)為棕褐色,見圖1A~C。

    表1 2 組組織標(biāo)本中LASP-1 蛋白表達(dá)情況比較Table 1 Comparison of LASP-1 protein expression in tissue samples from the 2 groups

    圖1 LASP-1 蛋白在不同組織中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of LASP-1 protein in different tissues

    2.2 不同臨床病理特征的NSCLC 患者其LASP-1蛋白表達(dá)情況比較

    不同性別、年齡、腫瘤大小和病理類型的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白陽性表達(dá)率無差異(P>0.05),但腫瘤低分化、TNM 分期Ⅲ期+Ⅳ期,浸潤深度T3+T4、以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者其LASP-1 蛋白的陽性表達(dá)率顯著較高(P<0.05),見表2。

    3 討論

    目前臨床上對于NSCLC 的治療主要以手術(shù)為主,但分析大量病例資料可知同樣病理類型和分期的NSCLC 患者予以相同標(biāo)準(zhǔn)化治療后,其預(yù)后效果仍存在著一定的差異。有研究顯示不同病理類型的預(yù)后差異可能與腫瘤病灶的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。根據(jù)既往文獻(xiàn)的報道,細(xì)胞中的LASP-1蛋白主要定位在胞漿[13]。但也有研究報道LASP-1 可存在于胞核中[14]。本研究結(jié)果中,LASP-1 蛋白主要存在于細(xì)胞漿中,與既往研究結(jié)果一致[15]。曾有文獻(xiàn)報道,腫瘤的TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為影響NSCLC 患者遠(yuǎn)期預(yù)后生存的主要因素[16]。而臨床分期仍舊為目前臨床上NSCLC診治的主要依據(jù)[17],故及時明確腫瘤病灶是否侵襲和轉(zhuǎn)移是評估患者預(yù)后的重要手段。

    本研究結(jié)果顯示,NSCLC患者癌組織中LASP-1蛋白陽性率表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,可提示,LASP-1 蛋白與NSCLC 的發(fā)生可能有著一定的聯(lián)系。另一方面,本組數(shù)據(jù)顯示,不同性別、年齡、腫瘤大小和病理類型的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白陽性率的表達(dá)無明顯差異,但腫瘤低分化、TNM 分期Ⅲ期+Ⅳ期,浸潤深度T3+T4、以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白的陽性表達(dá)率均顯著升高。進(jìn)一步表明,LASP-1 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 的惡性程度、分期以及病灶的侵襲、轉(zhuǎn)移等均有著密不可分的關(guān)系。結(jié)合以往生物學(xué)研究可知,LASP-1 基因染色體定位于17q11-q21.3[18]。LASP-1 蛋白中的SH3 和LIM 結(jié)構(gòu)域均在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起著極為重要的作用,。其中SH3 結(jié)構(gòu)領(lǐng)域可與palladin 蛋白、脂肪瘤多見融合伴侶、前白介素-16 和血管擴(kuò)張刺激磷蛋白和斑聯(lián)蛋白等進(jìn)行相互結(jié)合,從而起到一定的作用。曾有不少國內(nèi)外研究報道,LASP-1 蛋白在機(jī)體組織中可通過SH3 結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞偽足形成、延伸和侵襲起著一定的促進(jìn)作用[19]。故對于分化程度越低,浸潤程度越深以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其LASP-1 蛋白表達(dá)更高。而Krp1 蛋白是一種涉及偽足延伸和細(xì)胞運(yùn)動粘著斑蛋白。相關(guān)研究顯示,中的LIM 結(jié)構(gòu)域可與Krp1 蛋白相互作用,故在NSCLC 癌組織中,LASP-1 蛋白表達(dá)的升高可促使LIM 結(jié)構(gòu)域與LASP-1 結(jié)合共同定位于膜聯(lián)整合素CD44 和銜接蛋白Ezrin[20]。CD44與Ezrin 蛋白均介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)接觸,參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長。近年來,隨著病理學(xué)研究的不斷深入,有研究報道顯示,LASP-1 蛋白與口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移能力有關(guān),參與了腫瘤的進(jìn)展和侵襲過程[21]。對肝癌、食管鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、胃癌及膽囊癌研究亦發(fā)現(xiàn)LASP-1 蛋白高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和浸潤能力[22]。而本組數(shù)據(jù)結(jié)果也表明,腫瘤分化越低、分期越高以及出現(xiàn)周圍組織浸潤轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白表達(dá)水平更高。由此可見,LASP-1 蛋白與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖生長有著一定的聯(lián)系。

    表2 不同臨床病理特征的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白表達(dá)情況比較[(n,%)]Table 2 Comparison of LASP-1 protein expression in NSCLC patients with different clinicopathological features[(n,%)]

    綜上所述,LASP-1 蛋白在NSCLC 患者癌組織中表達(dá)水平較高,且與腫瘤分化程度、TNM 分期、浸潤深度和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。因此,LASP-1 蛋白表達(dá)水平的增加可能參與促進(jìn)NSCLC 腫瘤病灶的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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