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    銅對意大利蜜蜂工蜂生理機(jī)能的影響

    2019-05-27 08:16:56趙曉冬王紅芳胥保華
    中國蜂業(yè) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:中腸飼糧切片

    趙曉冬 王紅芳 胥保華

    (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,泰安 271018)

    銅是動物機(jī)體內(nèi)必需的微量元素,其影響機(jī)體的代謝和生長發(fā)育、免疫功能,其不僅通過構(gòu)成機(jī)體內(nèi)的含銅酶(如超氧化物歧化酶、銅藍(lán)蛋白等)參與機(jī)體代謝過程,而且參與機(jī)體造血、自由基防御等活動[1]。蜂蜜是蜜蜂在自然狀態(tài)下主要的能量食物,含有多種礦物質(zhì)。蜂蜜中常見的微量元素包括K、Na、Mg、Zn、Fe 和Cu 等20 多種,常量元素約占所有礦物質(zhì)的98%~99%[2]。Bounias 等研究了有機(jī)銅源葡萄糖酸銅和乳酸銅對蜜蜂蜂螨防治的效果,發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸銅效果更佳[3]。

    銅參與機(jī)體的抗氧化功能主要是通過影響含銅氧化酶的活性而發(fā)揮作用的。銅是銅鋅超氧化物歧化酶的重要組成部分,可以催化機(jī)體代謝的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為氧自由基和H2O2。蜜蜂中腸位于前胃之后,是消化和吸收的器官。中腸腸腔內(nèi)有多層的圍食膜,可保護(hù)中腸細(xì)胞減少磨損,使中腸消化酶穿過圍食膜消化食物,再由中腸細(xì)胞吸收分解的營養(yǎng)物。在分子水平,低濃度的Cu2+可以食物中銅對昆蟲生長發(fā)育有重要作用,銅水平對棕尾別麻蠅的影響得出:飼料中添加低濃度的銅能夠提高棕尾別麻蠅的生理功能,而高濃度的銅則會產(chǎn)生抑制作用[4]。在蜜蜂人工飼料中添加銅的有機(jī)鹽——葡萄糖酸銅可以提高蜂群的抗病能力,但是銅的適宜添加水平及其對蜜蜂生理機(jī)能的影響還有待進(jìn)一步研究證明。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)動物為意大利蜜蜂,取自蜂群健康、群勢基本相同的蜂群。試驗(yàn)用葡萄糖酸銅(山東西亞化學(xué)有限公司),貨號為L103479-25g,純度為98%。

    1.2 意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧配制

    試驗(yàn)采用6 種不同銅水平的人工幼蟲飼糧飼喂意大利蜜蜂工蜂,6 種飼糧分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F,飼糧組成見表1。

    1.3 飼養(yǎng)管理

    試驗(yàn)于2017年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院完成,供試蜂場為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)蜂場,蜜蜂在30℃和50%±5%R.H.的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。在飼養(yǎng)過程中保證培養(yǎng)箱和飼喂盒的衛(wèi)生,防止其他不利因素對蜜蜂產(chǎn)生的影響,飼養(yǎng)至蜜蜂全部死亡。分別于9日齡測定體成分、血淋巴生化指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)、相關(guān)基因的相對表達(dá)量、制作中腸切片,并測定壽命。

    1.4 測定指標(biāo)及相關(guān)方法

    1.4.1 離群意大利蜜蜂壽命的測定

    在23cm×9.5cm×5cm 蜂盒中飼養(yǎng),并置于培養(yǎng)箱中,調(diào)節(jié)恒溫恒濕培養(yǎng)箱的溫度為30℃,濕度為50%±5%,每天定時記錄死亡的蜜蜂數(shù),直至蜜蜂全部死亡。

    1.4.2 離群意大利蜜蜂工蜂中腸切片的制作

    選用組織石蠟包埋切片。

    1.4.3 離群意大利蜜蜂蜂體銅含量的測定

    從每試驗(yàn)組取9日齡的蜜蜂30 只,每10 只蜜蜂為一個重復(fù)。采用硝酸-雙氧水消解,ICP-ms 測定銅含量。

    表1 飼養(yǎng)離群意大利蜜蜂飼糧組成及銅水平

    表2 試驗(yàn)中PCR引物

    1.4.4 血淋巴生化指標(biāo)的測定

    采用體積為20μl 的毛細(xì)管吸取9日齡蜜蜂血淋巴50μl 于加有苯基硫脲的1.5ml 離心管中,于-80℃進(jìn)行保存。測定時,4℃條件下3000r/min離心10min,取上清備用,采用日立7020 型全自動生化分析儀測定蜂體血淋巴中總蛋白(TP)、總膽固醇(TCHO)。

    1.4.5 蜜蜂中抗氧化酶活性的測定

    從各試驗(yàn)組9日齡蜜蜂分別取出12 只蜜蜂,每3 只蜜蜂為一個重復(fù),使用SOD 試劑盒A007(南京建成生物工程研究所)測定SOD 活性。利用可見光分光光度計(jì)(UV-2000)測定吸光度并計(jì)算蜂體抗氧化能力。

    1.4.6 工蜂幼蟲蟲體溶菌酶、防衛(wèi)素1 基因相對表達(dá)量的測定

    采用Trizol 法提取總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將提取的總RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20℃保存?zhèn)溆?。目的基因引物設(shè)計(jì)參考序列來自于NCBI 數(shù)據(jù)庫,采用Primer 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì),以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因,委托生工生物科技有限公司合成引物,引物序列如表2所示。

    1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用SAS 9.2 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 氏法多重比較,P<0.01 表示差異極顯著,P<0.05 表示差異顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 銅對蜜蜂壽命的影響

    從蜜蜂存活率曲線圖來看,整個飼養(yǎng)期間,對照組A、處理組B、C 存活率明顯高于處理組D、E、F,10 天內(nèi),各處理組的存活率差異很小,自11 天起,處理組B 存活率明顯高于其他組(見圖1)。

    2.2 銅對蜜蜂中腸圍食膜的影響

    圖1 銅對蜜蜂存活率的影響

    圖2-1 A組蜜蜂中腸組織切片,H&E染色,100×

    圖2-2 B組蜜蜂中腸組織切片,H&E染色,100×

    圖2-3 C組蜜蜂中腸組織切片,H&E染色,100×

    圖2-4 D組蜜蜂中腸組織切片,H&E染色,100×

    圖2-5 E組蜜蜂中腸組織切片,H&E染色,100×

    圖2-6 F組蜜蜂中腸組織切片,H&E染色,100×

    圖3 離群蜜蜂體組織銅含量

    圖4 飼糧中銅水平對9日齡蜜蜂血淋巴生化性能的影響

    9日齡中腸切片顯示(100×)(見圖2),飼糧中銅的不同添加水平影響離群蜜蜂中腸圍食膜的結(jié)構(gòu)。對照組A、處理組B、C 蜜蜂中腸的PM 較厚且形態(tài)勻稱,而B 處理組PM 最厚;D、E、F 處理組蜜蜂中腸PM 的厚度不一。當(dāng)飼糧中銅水平為2.00μg/g 時對蜜蜂中腸圍食膜的結(jié)構(gòu)相對來說較為完整。

    表3 銅對離群蜜蜂Cu/Zn-SOD活性的影響

    表4 銅對蜜蜂CAT相對表達(dá)量的影響

    2.3 銅對蜜蜂體組織銅含量的影響

    由圖3可知,3、6、9日齡體組織Cu 含量也隨飼糧中Cu 水平不斷增加而顯著上升(P<0.05),對照組蜜蜂體組織Cu 含量顯著小于其他組(P<0.05)。

    2.4 銅對蜜蜂血淋巴生化指標(biāo)的影響

    由圖4可知,飼糧中銅的添加可顯著影響蜜蜂體中總蛋白、總膽固醇含量(P<0.05),隨著飼糧中銅添加水平的升高,9日齡蜜蜂體中總蛋白、總膽固醇含量均下降(P<0.05)。

    2.5 銅對蜜蜂抗氧化能力及相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

    2.5.1 銅對蜜蜂抗氧化能力的影響

    由表3可知,D 處理組3日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD活性顯著高于其他組(P<0.05),B 處理組6日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD 活性顯著高于對照組A 組以及其他處理組(P<0.05),3、6日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD 活性都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。

    2.5.2 銅對蜜蜂抗氧化相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

    由表4可知,銅顯著影響9日齡蜜蜂CAT基因表達(dá)量(P<0.05)。隨著幼蟲飼糧中銅水平的不斷升高,9日齡蜜蜂幼蟲CAT基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。

    2.5.3 銅對蜜蜂高親和力銅吸收蛋白基因相對表達(dá)量的影響

    由圖5可知,9日齡幼蟲F 處理組Ctr1基因的相對表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.01),隨著幼蟲飼糧中銅水平的不斷增加,9日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(P<0.05)。

    3 討論

    3.1 飼糧中銅的添加水平影響蜜蜂生長發(fā)育

    圖5 銅對9日齡蜜蜂Ctr1相對表達(dá)量的影響

    Adam 等[4]研究表明,Cu2+主要沉積在雙翅目幼蟲中腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。過量的Cu2+使中腸上皮細(xì)胞發(fā)生變性、腫脹、破裂[5]。本實(shí)驗(yàn)中,在飼糧中添加銅能夠保護(hù)腸道,有助于腸道的生長發(fā)育,當(dāng)蜜蜂飼糧糖漿中銅添加量在2.00μg/g 時能夠使中腸圍食膜的結(jié)構(gòu)較為均勻完整,有利于提高蜜蜂的健康水平。昆蟲取食含Cu2+的飼料后,Cu2+在體內(nèi)的積累量與飼料中Cu2+濃度存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系,并隨著取食時間的延長而增加[6]。在昆蟲體內(nèi)存在毒物興奮效應(yīng),即低濃度刺激、高濃度抑制的劑量反應(yīng)現(xiàn)象[7]。本研究中高劑量的Cu2+脅迫會顯著降低昆蟲的總蛋白和總脂濃度。

    3.2 飼糧中銅的添加水平影響蜜蜂的抗氧化能力

    在昆蟲體內(nèi)存在抗氧化酶系統(tǒng),如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等[8]。重金屬銅可與酶分子中的其他金屬離子發(fā)生競爭性替代作用而抑制酶活力,使昆蟲體內(nèi)生化反應(yīng)緩慢,并減弱昆蟲清除氧自由基能力,最終抑制昆蟲代謝和生長發(fā)育,延長其發(fā)育歷期。綜合本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中銅的添加水平為2.00~4.00μg/g時,意大利蜜蜂工蜂的抗氧化狀態(tài)最好。

    3.3 飼糧中銅的添加水平影響銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對表達(dá)量

    銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要包括銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ctr)和銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸化ATP 酶(Cu-ATPase)。Ctr1的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度有密切關(guān)系,其表達(dá)量的多少直接對機(jī)體銅代謝產(chǎn)生影響,銅缺乏時可促進(jìn)該蛋白的表達(dá),過量則抑制其表達(dá)。本研究表明銅的添加對于蜂體Ctr1的表達(dá)有顯著影響,其相對表達(dá)量在銅的添加水平0.00~10.00μg/g 的范圍內(nèi)有升高的趨勢,然而目前關(guān)于飼糧中銅水平對于其代謝相關(guān)酶的影響尚未見報(bào)道。

    4 結(jié)論

    (1)當(dāng)飼糧中銅的添加水平為2.00μg/g 時能顯著提高意大利蜜蜂工蜂的壽命,且對蜜蜂中腸食膜的結(jié)構(gòu)最為有利。

    (2)當(dāng)飼糧中銅的添加水平在0.00~10.00μg/g 的范圍內(nèi)不斷升高時,9日齡蜜蜂體組織銅含量顯著升高,銅對9日齡意大利蜜蜂過氧化氫酶基因相對表達(dá)量、高親和力銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對表達(dá)量顯著增加,但蜜蜂血淋巴中總蛋白和總膽固醇含量顯著降低。

    (3) 6日齡和9日齡蜜蜂蜂體超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)活性隨著銅的添加水平的提高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,都在2.00μg/g 時活性最高。

    (4) 綜合考慮以上指標(biāo),推薦意大利蜜蜂工蜂飼糧的適宜銅的添加水平為2.00~4.00μg/g。

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