雙歧桿菌聯(lián)合包裹液態(tài)氟碳陽離子脂質(zhì)納米粒增加HIFU消融效果：實驗研究

高 懸，鄒建中*，蔣冰蕾，徐 蝶，羅 勇，

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室 重慶微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010)

HIFU已廣泛用于治療實體腫瘤。由于超聲波在傳播過程中能量衰減較大，當(dāng)腫瘤體積較大或其位置深在時，HIFU療效會受到較大影響[1]。在靶區(qū)引入碘油、微泡等物質(zhì)，可通過改變組織的聲環(huán)境來增強HIFU消融效果；但這些物質(zhì)的靶向性不強，在腫瘤及其周圍組織器官內(nèi)均存在，輻照時易導(dǎo)致聲通道組織損傷[2-5]。近年來，研發(fā)體內(nèi)滯留時間長且靶向性強的HIFU增效劑逐漸受到關(guān)注。本研究探討HIFU生物靶向增效的可行性，以雙歧桿菌[5-7]作為載體，聯(lián)合包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒，觀察其增強HIFU消融的效果。

1 材料與方法

1.1 雙歧桿菌培養(yǎng)及鏡下觀察 將長雙歧桿菌ATCC15707(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系提供)于37℃、厭氧條件下，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，4℃條件下以1 000 r/min離心10 min。將細(xì)菌濃度調(diào)整至6×107/ml備用。革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察雙歧桿菌形態(tài)，并采用Malvern ZEN3600型分析儀測量其表面電位。

1.2 包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒制備及鏡下觀察 將二棕櫚?；蚜字?1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， DPPC；Avanti公司)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-氨基{1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG2000-Amine；Avanti公司}、膽固醇鹽酸鹽(DC-cholesterol hydrochloride， DC-CHOL；Avanti公司)按5∶2∶2的比例溶于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑成膜，加入雙蒸水洗脫后，滴加100 μl液態(tài)氟碳全氟己烷(perfluorohexanes， PFH；沸點56℃)，均質(zhì)乳化后獲得包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒，4℃保存?zhèn)溆?。于光學(xué)顯微鏡下觀察陽離子脂質(zhì)納米粒形態(tài)，并采用Malvern ZEN3600型分析儀測量其粒徑及表面電位。

1.3 雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒體外連接 將100 μl綠色熒光染料異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)標(biāo)記的雙歧桿菌(濃度1×106/ml)加入300 μl紅色熒光染料細(xì)胞膜紅色熒光探針(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate， DiI)標(biāo)記的陽離子脂質(zhì)納米粒(濃度1 mg/ml)中，孵育10 min后，稀釋200倍備用。采用Nikon A1R型激光共聚焦顯微鏡觀察雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒的連接情況，以CytoFLEX PN B49007AD型流式細(xì)胞儀檢測連接率。

1.4 建立荷瘤鼠模型 選取4周齡雌性BALB/c裸鼠48只(重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物實驗審查批準(zhǔn)號：CQLA-2016-406)，體質(zhì)量18～24 g，平均(21.14±2.04)g。將0.2 ml培養(yǎng)至對數(shù)生長期的濃度調(diào)為4×106/ml的人乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所提供)接種于每只裸鼠左側(cè)臀部皮下，之后常規(guī)飼養(yǎng)，待瘤體最大徑達0.8 cm時用于后續(xù)實驗。

1.5 HIFU輻照

1.5.1 分組處理 選取48只荷瘤鼠隨機均分為A組[磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)組]、B組(雙歧桿菌組)、C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)和D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)，每組12只。首先對A、C組荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2 ml PBS，B、D組荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2 ml雙歧桿菌(濃度1×106/ml)；而后于首次注射后72 h，對A、B組再注射0.2 ml PBS，C、D組再注射0.2 ml陽離子脂質(zhì)納米粒(濃度0.1 mg/ml)。

1.5.2 HIFU輻照及評價 采用海扶JC200型聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)，于第2次注射完成后24 h在超聲監(jiān)控下行HIFU輻照。消融參數(shù)：治療頭頻率0.94 MHz，焦距145 mm，換能器直徑220 mm；輻照方式為點輻照，功率150 W，輻照時間2 s。輻照后即刻，通過聲像圖觀察荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化，與輻照前對照，系統(tǒng)自動測得灰度變化值。

1.6 組織學(xué)觀察 HIFU輻照前1 h，從各組中各隨機選取2只處死，完整剝離腫瘤并摘取荷瘤鼠心、肝、脾、肺、腎組織，以4%多聚甲醛固定，革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織及重要臟器中雙歧桿菌的生長情況，驗證雙歧桿菌的腫瘤靶向性。HIFU輻照后1天，將荷瘤鼠全部處死，完整剝離腫瘤后，沿最大面切開，用2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride， TTC)染色，肉眼觀察其大體組織學(xué)情況，并測算各組荷瘤鼠腫瘤組織凝固性壞死體積和HIFU消融能效因子(energy efficiency factor， EEF)。凝固性壞死體積(mm3)=(π/6)×長度(mm)×寬度(mm)×深度(mm)，EEF(J/mm3)=聲功率(W)×輻照時間(s)/凝固性壞死體積(mm3)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙歧桿菌和陽離子脂質(zhì)納米粒的表征 雙歧桿菌革蘭氏染色呈藍紫色的長棒狀(圖1A)，表面電位為-29 mV(圖1B)。陽離子脂質(zhì)納米粒呈球形，分布均勻(圖2A)，粒徑220～340 nm，平均(280.21±60.20)nm(圖2B)，表面電位為25 mV(圖2C)。

圖1 雙歧桿菌表征 A.光學(xué)顯微鏡下觀察(革蘭染色，×400)； B.表面電位檢測圖2 包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒表征 A.光學(xué)顯微鏡下觀察(×400)； B.粒徑檢測； C.表面電位檢測

2.2 體外連接情況 雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒體外連接后，激光共聚焦顯微鏡下可見FITC標(biāo)記的雙歧桿菌表面附著大量被DiI標(biāo)記的陽離子脂質(zhì)納米粒(圖3)。流式細(xì)胞儀檢測其連接率為99.9%(圖4)。

2.3 HIFU消融效果

2.3.1 灰度變化值 HIFU輻照后，4組荷瘤鼠腫瘤組織聲像圖均可見不同程度灰度變化(圖5)。各組間灰度變化值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=143.40，P<0.001，表1)，A組

2.3.2 凝固性壞死體積 HIFU輻照后，4組荷瘤鼠腫瘤組織內(nèi)均可見凝固性壞死，壞死區(qū)呈灰白色，而未壞死區(qū)切面呈紅色(圖6)。各組間凝固性壞死體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=243.20，P<0.001，表1)，A組

表1 各組荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化值、EEF及凝固性壞死體積(±s)

表1 各組荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化值、EEF及凝固性壞死體積(±s)

組別灰度變化值凝固性壞死體積(mm3)EEF(J/mm3)A組10.44±2.7437.48±7.13816.62±3.65B組18.78±3.5348.91±7.4512.57±2.19C組26.44±3.7173.62±8.588.26±1.04D組43.33±3.94131.60±10.464.59±0.40F值143.40243.2056.33P值<0.001<0.001<0.001

注：A組：PBS組；B組：雙歧桿菌組；C組：陽離子脂質(zhì)納米粒組；D組：雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組

2.3.3 EEF 各組間EEF差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.33，P<0.001，表1)，A組>B組>C組>D組，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表2)。

2.3.4 靶向性 4組荷瘤鼠心、肝、脾、肺、腎組織中均無雙歧桿菌生長；A、C組腫瘤組織中無雙歧桿菌，B、D組腫瘤組織中可見大量雙歧桿菌(圖7)。

3 討論

微泡、羥基磷灰石納米復(fù)合物等現(xiàn)有HIFU增效劑存在靶向性不強的問題，對HIFU消融增效有限；目前仍在不斷探索，以提升HIFU消融效率。本研究利用雙歧桿菌能夠靶向腫瘤乏氧區(qū)的特性，將其與具有HIFU增效作用的包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)HIFU增效劑靶向性不強的問題。本研究結(jié)果顯示，表面帶有負(fù)電荷的雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒在體外可通過靜電吸附的方式有效連接，連接率達99.9%。本研究中C組荷瘤鼠HIFU輻照后腫瘤組織灰度變化值及凝固性壞死體積均明顯高于A組(P均<0.001)，表明包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒具有增效HIFU的作用，與周洋等[8]研究結(jié)果相符；此外，D組灰度變化值及凝固性壞死體積均明顯高于C組(P均<0.001)，分析其原因：①雙歧桿菌增殖可能改變了腫瘤組織局部聲環(huán)境，使超聲能量沉積增加，進而增強HIFU消融腫瘤效果；②包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒在腫瘤中的滯留量增加，增強了HIFU消融腫瘤的效果。腫瘤組織中陽離子脂質(zhì)納米粒滯留量增加的原因可能包括：①雙歧桿菌在腫瘤組織中生長72 h后，通過靜電吸附作用可連接數(shù)量較多陽離子脂質(zhì)納米粒；②雙歧桿菌在腫瘤組織中增殖，不僅可提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，還能通過提高局部一氧化氮水平而增強滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect， EPR)效應(yīng)和腫瘤血管通透性[9-11]，使陽離子脂質(zhì)納米?！奥┤搿蹦[瘤組織中的數(shù)量增多。

表2 荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化值、EEF及凝固性壞死體積組間兩兩比較的P值

注：A組：PBS組；B組：雙歧桿菌組；C組：陽離子脂質(zhì)納米粒組；D組：雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組

圖5 HIFU輻照后各組荷瘤鼠腫瘤組織聲像圖 A.A組(PBS組)； B.B組(雙歧桿菌組)； C.C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)； D.D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)

圖6 HIFU輻照后各組荷瘤鼠腫瘤組織大體病理圖，箭示凝固性壞死 A.A組(PBS組)； B.B組(雙歧桿菌組)； C.C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)； D.D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)

圖7 雙歧桿菌的腫瘤靶向性(革蘭染色，×400)，箭示雙歧桿菌 A.A組(PBS組)； B.B組(雙歧桿菌組)； C.C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)； D.D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)

此外，EEF也可反映HIFU消融腫瘤的效果，EEF越小，表明消融效果越強，本研究中D組EEF明顯低于其他各組(P均<0.05)。

本研究通過動物實驗證實，雙歧桿菌聯(lián)合包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒具有增效HIFU消融腫瘤的作用；但本研究為初步探索，具體機制有待進一步研究。