何首烏飲對衰老生精細(xì)胞p53、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響*

單博穎，薛亞然，梁 思，張 研，齊 峰，牛嗣云△

（1.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院；3.保定市第一醫(yī)院）

細(xì)胞凋亡在睪丸細(xì)胞的分化、精子的成熟及存活中發(fā)揮重要作用[1]。研究顯示，生精細(xì)胞異常凋亡會(huì)引發(fā)男性不育癥等[2]。中藥復(fù)方在治療男性不育癥和延緩衰老方面發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3]，何首烏飲能降低睪丸組織細(xì)胞凋亡率，并且能通過提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成酶的活性促進(jìn)睪酮分泌，改善自然衰老大鼠精子的質(zhì)量。為進(jìn)一步明確何首烏飲減少大鼠生精細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，本研究觀察了何首烏飲對衰老生精細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級雄性Wistar大鼠，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（動(dòng)物許可證號1510063）。

何首烏飲方藥的組成：取何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓，按質(zhì)量比為3：2：3：2：5：3混合。選用北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒配成何首烏飲中藥顆粒劑。飲片與顆粒的當(dāng)量比，制何首烏1：10，肉蓯蓉1：10，懷牛膝1：5，炙淫羊藿1：20，丹參1：10，茯苓1：5。

何首烏飲給藥劑量：生藥4.8g/100g作為給藥量。根據(jù)北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的配方顆粒的飲片與顆粒當(dāng)量比換算，大鼠給藥量為0.56g/100g（將0.56g顆粒溶于0.8ml生理鹽水中灌胃，含藥量0.7g/ml）。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Gibcos公司；特級胎牛血清，以色列Biological Industries公司；膠原酶IV，美國Sigma公司；Trizol Reagent，美國Ambion公司；PrimeScript RT reagent Κit with Gdna Eraser、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus），日本TaΚaRa公司。安捷倫Mx 3000P熒光定量PCR儀，美國AgiLent techno-Logies公司；全波長酶標(biāo)儀，美國BioTek Epoch公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含藥血清的制備：Wistar大鼠15只，體重320～360g，何首烏飲灌胃給藥，每天2次，連續(xù)7天。第7天給藥1小時(shí)后，以6%水合氯醛麻醉大鼠，自內(nèi)眥取血，分離血清，過濾后無菌分裝，-80℃冷凍保存。

1.3.2 采用生精細(xì)胞和支持細(xì)胞共培養(yǎng)的方法培養(yǎng)生精細(xì)胞[4]：

⑴支持細(xì)胞：雄性大鼠出生后第15～20天取出雙側(cè)睪丸[5]，使用IV型膠原酶和胰蛋白酶消化使曲精小管斷裂，然后培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于34℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，待細(xì)胞混懸液中的間質(zhì)細(xì)胞基本貼壁后轉(zhuǎn)移上清液至另一新的培養(yǎng)瓶中，于34℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至3天。采用蘇丹IV染色進(jìn)行鑒定。

⑵精原干細(xì)胞：雄性大鼠出生后第7～9天取出雙側(cè)睪丸[6]，采用兩步酶消化法從睪丸組織中初步分離精原干細(xì)胞，差異貼壁法進(jìn)一步純化后，培養(yǎng)在含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于34℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，待大部分間質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中計(jì)數(shù)，以5×105～7×105個(gè)/ml接種于支持細(xì)胞中。上述支持細(xì)胞培養(yǎng)第5天時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，收集消化下來的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)密度為2×105～3×105個(gè)/ml接種在六孔板中，48小時(shí)后接種精原干細(xì)胞，接種后繼續(xù)培養(yǎng)7天。采用堿性磷酸酶染色和HE染色進(jìn)行鑒定。

1.3.3 衰老細(xì)胞模型的建立：采用自由基氧化損傷法[7]建立生精細(xì)胞衰老模型。將培養(yǎng)7天的生精細(xì)胞中直接加入終濃度為50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4，繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3天，以建立衰老模型。采用β-半乳糖甘酶染色進(jìn)行鑒定。

1.3.4 細(xì)胞分組：生精細(xì)胞分為3組：①正常組（NG組），培養(yǎng)7天的生精細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)80小時(shí)。②衰老組（AG組），按照1.3.3的方法建立衰老模型。③何首烏飲組（SWYG組），按照1.3.3的方法建立生精細(xì)胞衰老模型后，加入終濃度為10%的何首烏飲含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)3天。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測生精細(xì)胞Bcl-2、Bax和p53 mRNA的表達(dá)：由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成Bcl-2、Bax和p53基因的引物序列（附表）。用Trizol法提取生精細(xì)胞的總RNA，酶標(biāo)儀檢測濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA，按照試劑盒操作進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 31s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用2-△△Ct方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

附表 各基因引物序列及產(chǎn)物大小

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用（±s）表示，使用單因素方差分析比較組間差異，若方差齊，兩兩比較采用最小顯著差法（least significant difference，LSD），如果方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的鑒定 支持細(xì)胞培養(yǎng)5天連接成片，密集生長（圖1A）。精原干細(xì)胞與支持細(xì)胞共培養(yǎng)2天后，精原干細(xì)胞附著于支持細(xì)胞表面，精原干細(xì)胞呈圓形或卵圓形（圖1B）；共培養(yǎng)7天后，精原干細(xì)胞分裂增殖，可見各級生精細(xì)胞（圖1C）。

蘇丹IV染色結(jié)果，支持細(xì)胞胞質(zhì)中可見染成橘紅色的脂滴，支持細(xì)胞純度可達(dá)90%以上（圖1D）。HE染色可見成簇存在且著色為紫紅色的圓形細(xì)胞為各級生精細(xì)胞，淡紫色且呈不規(guī)則形狀的是支持細(xì)胞（圖1E）。堿性磷酸酶染色，可見精原細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)灰黑色顆粒，精子細(xì)胞弱陽性或不著色（圖1F），支持細(xì)胞不著色。

圖1 支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定（標(biāo)尺=50 μm）

2.2 生精細(xì)胞衰老模型的鑒定 β-半乳糖苷酶染色陽性產(chǎn)物呈藍(lán)色，定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2A-B）。結(jié)果顯示衰老 組生精細(xì)胞陽性細(xì)胞率明顯高于正常組（P＜0.05，圖2C），衰老組β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率可達(dá)80%以上。

圖2 生精細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色結(jié)果（標(biāo)尺=50μm）

2.3 何首烏飲對衰老生精細(xì)胞p53、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 AG組生精細(xì)胞p53和Bax mRNA的表達(dá)明顯高于NG組（P＜0.05），Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯低于NG組（P＜0.05）。何首烏飲干預(yù)后，生精細(xì)胞中p53和Bax mRNA的表達(dá)明顯低于AG組（P＜0.05），Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯高于AG組（P＜0.05）。Bax/Bcl-2比值A(chǔ)G組明顯高于NG組（P＜0.05），何首烏飲干預(yù)后，該比值明星低于AG組（P＜0.05）。見圖3-4：

圖3 各組生精細(xì)胞p53、Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)情況

圖4 各組生精細(xì)胞Bax/Bcl-2比值

3 討論

中醫(yī)藥通過提高機(jī)體的抗氧化能力、提高免疫力、降血脂等多方面發(fā)揮抗衰老的作用，具有很好的臨床療效[8]。何首烏飲是由何首烏丸加味而成。何首烏丸是劉河間《宣明論》中的傳統(tǒng)臨床驗(yàn)方，以何首烏為主藥，配以肉蓯蓉和懷牛膝，在此基礎(chǔ)上增加了淫羊藿、丹參、茯苓。前期研究證明，何首烏飲可以通過調(diào)控線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，抑制睪丸生精細(xì)胞凋亡，改善生精功能，延緩睪丸組織退化[9]。

細(xì)胞過度凋亡是睪丸生殖功能降低的重要原因之一[10]。研究表明，p53是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)控因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)功能有關(guān)[11]。p53基因在正常細(xì)胞中低表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，可誘導(dǎo)細(xì)胞中p53高表達(dá)。p53的編碼產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)Bax的表達(dá)，Bax可介導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞凋亡；同時(shí)，p53可能通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。Bax是一種促凋亡基因，能夠拮抗Bcl-2的抑制凋亡的作用。Bcl-2和Bax是一對正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)基因，二者形成同源二聚體或異二聚體來促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。因此，Bax/Bcl-2比值對于決定細(xì)胞接受刺激信號后存活起著關(guān)鍵作用。如Bcl-2過量表達(dá)有利于細(xì)胞存活，如Bax過量表達(dá)，則細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。

何首烏飲屬于中藥復(fù)方，雖然所包含的化學(xué)成分并不十分清楚，但已有的研究表明，何首烏中的二苯乙烯苷、淫羊藿中的淫羊藿苷、丹參中的丹參酮IIA均可通過調(diào)控線粒體通路關(guān)鍵基因發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[14-16]。本研究結(jié)果提示，何首烏飲能夠抑制生精細(xì)胞p53和Bax mRNA的表達(dá)水平，提高Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，從而延緩生精細(xì)胞衰老，抑制生精細(xì)胞凋亡，但還需其它實(shí)驗(yàn)方法對本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。