絲膠對2型糖尿病大鼠胰腺Akt的調(diào)節(jié)作用*

劉東慧，劉陳霏，宋妤軒，阮鴻嬌，陳志宏△

（1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000；2.中國藥科大學(xué)）

2型糖尿病是一種由胰島素相對或絕對分泌不足導(dǎo)致的以血糖升高為主要臨床表現(xiàn)的代謝性疾病。在胰腺，胰島素由胰島β細胞分泌后與胰島素受體(insulin receptor，IR)結(jié)合而啟動磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phos-phatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，啟動后的PI3K/Akt信號通路通過調(diào)控胰島素分泌，維持β細胞的生長、增殖等途徑來實現(xiàn)胰島素降低血糖的作用[1-2]。絲膠是從蠶繭中提取的一種天然水溶性蛋白，具有生物相容性，可降解。Akt作為PI3K/Akt信號通路中的關(guān)鍵因子之一，本研究在前期發(fā)現(xiàn)絲膠能有效降低血糖的基礎(chǔ)上[3]，進一步觀察了絲膠對2型糖尿病大鼠模型胰腺Akt mRNA表達的調(diào)節(jié)作用，以期揭示絲膠降血糖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 絲膠的提取 蠶繭經(jīng)1%的Na2CO3浸泡30min后沸煮3h(2次)，將提取液濃縮、透析凍干至粉末備用。

1.2 動物分組及處理 SPF級雄性SD大鼠，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。36只大鼠隨機分為正常組、模型組和實驗組，每組12只。給予造模大鼠高脂高糖飼料+腹腔注射STZ(35mg/kg/d，連續(xù)2d)處理，以空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠為成功2型糖尿病大鼠模型。成模后，實驗組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d)連續(xù)灌胃35d，正常組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水連續(xù)灌胃35d。用藥結(jié)束，將各組大鼠麻醉后，取血、處死，迅速取出胰腺加入Trizol放于液氮中研磨，研磨充分后放液氮中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測血糖 將取得的各組大鼠血液標(biāo)本離心、分離血清后送承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科檢測血糖。

1.4 檢測胰腺Akt mRNA的表達 采用Real Time Q-PCR法：取適量胰腺組織提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。利用pGM-T質(zhì)粒載體成功構(gòu)建Akt和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品后測定其濃度用以后續(xù)定量。擴增各組大鼠的Akt和GAPDH得標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴增曲線、溶解曲線，PCR引物設(shè)計與合成由寶生物工程(大連)有限公司完成，以Akt與相應(yīng)GAPDH拷貝數(shù)的比值作為各組大鼠Akt mRNA的相對表達水平，PCR引物序列見表1。

表1 引物序列和產(chǎn)物大小

1.5 統(tǒng)計分析 各組大鼠血糖及胰腺Akt mRNA的表達均以（±s）表示，采用IBM SPSS Statistics 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，多組間差異的比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異采用Tukey’s檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖水平 模型組大鼠血糖明顯高于正常組大鼠(P＜0.05)，實驗組大鼠血糖明顯低于模型組大鼠(P＜0.05)。見表2：

表2 各組大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表達水平（±s ）

表2 各組大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表達水平（±s ）

與模型組比較：*P＜0.05

組別 n 血糖(mmol/L) Akt mRNA正常組 12 10.83±2.03* 58.14±16.39*模型組 12 29.45±4.82 28.83±8.06實驗組 12 13.20±4.09* 46.37±12.57*

2.2 胰腺Akt mRNA的表達 Akt標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為1.57×107～1.57×104，以pGM-T-Akt陽性質(zhì)粒DNA和各組大鼠cDNA做為模板，經(jīng)過Real Time Q-PCR法擴增后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴增效率為94.859%，斜率為-3.452，相關(guān)系數(shù)r為-0.998，截距為36.253；擴增曲線均呈S型；溶解曲線呈單峰（附圖）。各組大鼠Akt mRNA表達的定量分析結(jié)果見表2：模型組大鼠Akt mRNA的表達量明顯低于正常組大鼠(P＜0.05)，實驗組大鼠Akt mRNA的表達量明顯高于模型組大鼠(P＜0.05)。

（1.標(biāo)準(zhǔn)曲線，2.擴增曲線，3.溶解曲線）

3 討論

目前，2型糖尿病的發(fā)病率逐年增高，已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共健康問題，臨床用于治療糖尿病的各類藥物雖能有效降低血糖，但長期服用均會產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，探尋一種天然藥物來彌補目前降糖藥的不足十分必要。絲膠來源于蠶繭，課題組前期發(fā)現(xiàn)絲膠能有效降低血糖[3]，但機制尚不明了。

胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，與IR結(jié)合后啟動PI3K/Akt信號通路，從而激活A(yù)kt?；罨腁kt通過調(diào)控與細胞周期相關(guān)的酶來維持胰島β細胞的細胞周期，促進β細胞增殖[4-5]；活化的Akt可使凋亡基因失活，抑制β細胞凋亡[6]；活化的Akt還可調(diào)節(jié)β細胞分泌胰島素，促進外周靶組織攝取葡萄糖，減輕胰島素抵抗[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，Akt激酶失活的轉(zhuǎn)基因小鼠，其胰島β細胞Akt活性明顯下降，進而出現(xiàn)胰島素分泌缺陷[8]。因此，在胰島β細胞的生長、增殖、再生、凋亡及分泌胰島素中，PI3K/Akt信號通路發(fā)揮著十分重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胰腺Akt mRNA的表達明顯降低。Akt是PI3K/Akt信號通路中的關(guān)鍵因子之一，其表達降低可通過影響β細胞的增殖、凋亡及胰島素的分泌而導(dǎo)致胰島素的生理作用減弱，從而引發(fā)模型組大鼠血糖明顯升高。實驗組大鼠給予絲膠灌胃后，Akt mRNA的表達明顯升高，提示絲膠可通過上調(diào)胰腺Akt mRNA的表達，改善糖尿病時胰島β細胞中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，從而發(fā)揮降低血糖的作用，這可能是絲膠降低血糖的作用機制之一。