鮮切生菜中熒光假單胞菌生長動力學(xué)模型和貨架期預(yù)測

徐曉霞， 陳安均， 王婷玉， 李家欣， 趙江欣， 李見森， 敖曉琳

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

鮮切生菜 （fresh-cut lettuce）是新鮮生菜經(jīng)清洗、切割、包裝等加工過程制成的即食產(chǎn)品[1]。鮮切生菜以其新鮮、衛(wèi)生、方便、環(huán)保及健康的特點已成為國內(nèi)外生菜加工的主流，鮮切生菜憑著自身的優(yōu)勢，將進入一個快速發(fā)展的階段[2-4]。

鮮切生菜在流通過程中極易發(fā)生品質(zhì)變化，且病理因素引起的腐爛變質(zhì)是品質(zhì)變化的最主要因素[5]，雖然在不同條件貯藏時受到各類微生物的侵染，但只有部分微生物在腐敗中占據(jù)主導(dǎo)地位[6]。對鮮切生菜來說，主要是外在因素影響微生物的生長和種類，而溫度是最重要的因素[7]，也是加工和儲藏過程中最不穩(wěn)定的環(huán)境因素[8]，同時也是惟一不受食品包裝類型影響的環(huán)境因子[9]。由于鮮切生菜貨架期較短，傳統(tǒng)的微生物檢測方法已經(jīng)不能滿足實際生產(chǎn)的需要，因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、簡便的貨架期預(yù)測方法是鮮切生菜行業(yè)發(fā)展的必然趨勢[10]。不同溫度貯藏鮮切生菜微生物生長模型的建立，已成為鮮切生菜貨架期預(yù)測的有效方法，同時還可以在很大程度上減少經(jīng)濟損失。

研究人員通過分析發(fā)現(xiàn)，溫度是對假單胞菌的生長數(shù)量影響最大的一個因素[7]。作者利用從鮮切生菜中分離純化并鑒定得到的優(yōu)勢腐敗菌熒光假單胞菌為試驗菌株，研究了鮮切生菜不同貯藏溫度下的微生物生長情況。通過修正的Gompertz模型建立了熒光假單胞菌的溫度生長預(yù)測模型，以期快速預(yù)測鮮切生菜中熒光假單胞菌的生長，研究了溫度對熒光假單胞菌生長速率和延滯期的影響。同時根據(jù)一級模型和二級模型建立鮮切生菜的剩余貨架期模型，為鮮切生菜剩余貨架期預(yù)測以及產(chǎn)品安全性評估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗材料 健壯、無機械傷、清潔、成熟度基本一致的新鮮生菜，購買于雅安農(nóng)貿(mào)市場，迅速運回實驗室后置于4℃冰箱中備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯（NB）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基與選擇性培養(yǎng)基添加物：青島高科技海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 供試菌株 熒光假單胞菌（Pseudomonas fulva）：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院果蔬保鮮實驗室從不同溫度貯藏條件下貨架期終點的鮮切生菜中分離純化并鑒定得到的鮮切生菜的優(yōu)勢腐敗菌株。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 立式自動壓力蒸汽滅菌鍋GI54DW：致微（廈門）儀器有限公司；生物安全柜HR20-ⅡA2：青島海爾特種電器有限公司；人工氣候箱GZ-380-GSI：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱BPC-250 F：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將活化后的熒光假單胞菌接種于無菌營養(yǎng)肉湯中，30℃下?lián)u床培養(yǎng)至穩(wěn)定期，用5 mL 0.85%的無菌生理鹽水對活化后熒光假單胞菌的菌懸液進行離心洗脫，操作重復(fù)3次。加入5 mL無菌生理水重懸菌液，渦旋振蕩30 s制成菌懸液。用無菌生理鹽水2倍稀釋菌懸液至合適濃度，于600 nm波長下比色，記錄OD值。各稀釋濃度均以傾注平板法計數(shù)，根據(jù)OD值和菌落數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將熒光假單胞菌制備成菌懸液后，根據(jù)OD值稀釋至所需濃度，接種前以平板法計數(shù)，以105cfu/mL左右的菌懸液進行接種[11]。

1.2.2 鮮切生菜接種 新鮮生菜經(jīng)流動自來水沖洗，去除表面雜物，用滅菌的不銹鋼刀分成長寬各3 cm左右的塊，切分好的生菜4℃無菌蒸餾水清洗3次，在手動果蔬甩干機中甩干后備用。利用微型噴霧器對鮮切生菜噴霧接種，以無菌水作對照處理，取200 g為一組，分為若干組，用0.02 mm聚乙烯保鮮袋包裝[11]。

1.2.3 鮮切生菜貯藏與取樣 當(dāng)日對第一組進行微生物計數(shù)，其余組分別置于樂扣箱中，分別置于0、4、7、10、15、25 ℃條件下貯藏，每處理分 3 組，實驗重復(fù)3次，0、4、7℃每24小時取樣，10℃每12 h取樣，15℃每6 h取樣，25℃每5 h取樣。

1.2.4 鮮切生菜感官評價 由經(jīng)過培訓(xùn)的感官評定人員10名對貯藏過程中鮮切生菜的顏色、質(zhì)地、氣味及外型進行感官評分，取平均值，以評價鮮切生菜的質(zhì)量。生菜的感官評價采用9分制評分法，5分為商品界限，即為貨架期終點（感官拒絕點）[12]，結(jié)果見表1。

表1 鮮切生菜感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of fresh-cut lettuce

1.2.5 微生物計數(shù) 取樣品勻漿，取10 g漿液，加入到90 mL 0.85%滅菌的生理鹽水中，充分均質(zhì)后，10倍梯度稀釋。選取合適梯度的稀釋液0.1 mL，涂布假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基與假單胞分離瓊脂（PIA），每個稀釋度做3個平行，吸取0.1 mL空白稀釋液作對照，30℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)結(jié)果進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。

1.2.6 數(shù)學(xué)模型的建立和驗證

1）熒光假單胞菌最小腐敗量的確定：微生物的生長能夠產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物，當(dāng)其達到一定水平導(dǎo)致產(chǎn)品不可接受時的微生物數(shù)量即最小腐敗量[13]。感官評分和優(yōu)勢腐敗菌數(shù)量建立線性回歸方程，根據(jù)感官拒絕分值確定最小腐敗量。

2）熒光假單胞菌初級模型的建立：在0、4、7、10、15、25℃條件下貯藏鮮切生菜，得到熒光假單胞菌試驗數(shù)據(jù)。用修正的Gompertz模型通過MATLAB的cftool擬合工具箱擬合得到不同溫度下熒光假單胞菌的生長曲線，確定一級模型參數(shù)[14]。

修正的Gompertz模型：

最大細菌數(shù)量：Nmax=N0+a

式中：N（t）和 N0分別表示 t時微生物數(shù)量（lg（cfu/g））和微生物初始數(shù)量（lg（cfu/g））；t為時間（h）；λ 為遲滯時間（h）；μmax為微生物生長的最大比生長速率（h-1）；A為穩(wěn)定期最大菌落數(shù)量與初始菌數(shù)的差值 （對數(shù)值 lg（cfu/g））。

3）溫度對熒光假單胞菌生長動力學(xué)的影響：平方根模型是不同溫度下基于微生物最大比生長速率（μmax）和遲滯時間（λ）與溫度之間的線性關(guān)系的經(jīng)驗?zāi)Ｐ蚚15-16]。利用MATLAB根據(jù)下式建立溫度對熒光假單胞菌影響的二級模型。

式中，T為培養(yǎng)溫度；Tminμ和Tminλ為生長速率為零時的溫度值；bμ和bλ為待定系數(shù)。

1.2.7 預(yù)測模型的驗證和評價 利用已建立的數(shù)學(xué)模型求得7℃和15℃貯藏時鮮切生菜中熒光假單胞菌的預(yù)測值，與在7℃和15℃貯藏時熒光假單胞菌實際生長數(shù)值對比，利用準(zhǔn)確度（Accuracy factor，Af）和偏差度（Bias factor，Bf）來評價所建模型的準(zhǔn)確性，對預(yù)測模型進行驗證，評價已經(jīng)建立的熒光假單胞菌生長動力學(xué)模型的可靠性[17]。Af代表預(yù)測值和實際值的相近程度，準(zhǔn)確因子在1.1～1.9可以被接受。Bf代表預(yù)測值與實際值之間的偏差，偏差因子在0.75～1.25模型可以被接受，可以作為研究該產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)的預(yù)測模型[18]。準(zhǔn)確度和偏差度的表達式為：

式中，N1為鮮切生菜貯藏過程中檢測到的熒光假單胞菌數(shù)量；N2為利用熒光假單胞菌動力學(xué)預(yù)測模型得到的熒光假單胞菌數(shù)量；n是試驗次數(shù)。

1.2.8 鮮切生菜剩余貨架期預(yù)測模型的建立和驗證 基于鮮切生菜熒光假單胞菌生長動力學(xué)一級模型和二級模型，應(yīng)用鮮切生菜初始熒光假單胞菌數(shù)量（N0）、最小腐敗量（Ns）和最大菌數(shù)（Nmax）建立剩余貨架期（Shelf life，SL），即從初始微生物數(shù)量增值到最小腐敗量所需要的時間。貨架期預(yù)測模型的表達式為：

式中，SL為貨架期；λ為遲滯時間（h）；Nmax為最大菌數(shù)對數(shù)值（lg（cfu/g））（最大菌數(shù)的確定采用不同溫度下最大菌數(shù)的均值）；N0為初始微生物數(shù)量對數(shù)值（lg（cfu/g））；Ns為最小腐敗量（lg（cfu/g））；Nmax為微生物生長的最大比生長速率（h-1）。

將貯藏在7℃和15℃條件下鮮切生菜的實際貨架期和鮮切生菜貨架期預(yù)測模型預(yù)測的貨架期進行比較，對鮮切生菜剩余貨架期預(yù)測模型進行驗證。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 感官評分與微生物指標(biāo)數(shù)據(jù)采用MATLAB進行相關(guān)性分析，微生物計數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)換為 lg（cfu/g），熒光假單胞菌的試驗數(shù)據(jù)通過MATLAB的擬合工具箱進行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光假單胞菌最小腐敗量的確定

鮮切生菜不同溫度貯藏條件下感官評分和熒光假單胞菌數(shù)（lg（cfu/g））建立線性回歸方程，根據(jù)感官拒絕分值確定最小腐敗量。由表2可知，在不同溫度條件下（0、4、10、25 ℃），鮮切生菜的最小腐敗量（Ns）平均值為 6.966 3 lg（cfu/g），即貨架期終點的熒光假單胞菌數(shù)為6.966 3 lg（cfu/g）。

2.2 鮮切生菜中熒光假單胞菌生長動力學(xué)模型的建立

根據(jù)熒光假單胞菌在 0、4、7、10、15、25 ℃條件下的計數(shù)結(jié)果，擬合修正的Gompertz模型，繪制不同溫度下的生長曲線，結(jié)果見圖1，擬合參數(shù)見表3。結(jié)果表明，不同溫度下擬合方程相關(guān)系數(shù)R2分別為 0.990 6、0.994、0.992 6、0.994、0.998、0.991 7，均大于0.95，均方根均小于0.17，方差和均小于0.2，表明修正的Gompertz方程能夠很好的擬合不同溫度貯藏條件下鮮切生菜中熒光假單胞菌的生長曲線。隨著溫度的升高，延滯時間（λ）逐漸減小，最大比生長速率（μmax）逐漸增大。

表2 不同溫度貯藏鮮切生菜貨架期終點熒光假單胞菌數(shù)量Table 2 Pseudomonas fulva amounts in the end of shelf life of fresh cut lettuce at different temperature

2.3 溫度對熒光假單胞菌生長動力學(xué)參數(shù)的影響

熒光假單胞菌初級模型的建立不能反映溫度變化對鮮切生菜中熒光假單胞菌生長的影響，需采用平方根模型對其進行描述。溫度和最大比生長速率（μmax）和遲滯時間（λ）的關(guān)系見圖2。 溫度與最大比生長速率和延滯時間均呈較好的線性關(guān)系，最大比生長速率和延滯時間的R2分別為0.978 3和0.979 8，溫度對熒光假單胞菌生長最大比生長速率和延滯時間的平方根模型為：

2.4 熒光假單胞菌生長動力學(xué)模型的驗證和評價

為了定量評價所建鮮切生菜中熒光假單胞菌生長動力學(xué)模型的可靠性[20]，對預(yù)測模型進行驗證，采用準(zhǔn)確度 （Accuracy factor，Af） 和偏差度（Bias factor，Bf）來評價所建模型的準(zhǔn)確性，利用已建立的數(shù)學(xué)模型求得7℃和15℃貯藏時，鮮切生菜中熒光假單胞菌的預(yù)測值與相應(yīng)溫度貯藏試驗中熒光假單胞菌的實際檢測值對比，結(jié)果見表4。預(yù)測模型的準(zhǔn)確度和偏差度，結(jié)果見表5。

圖1 不同溫度貯藏鮮切生菜熒光假單胞菌的生長動力學(xué)模型Fig.1 Growth kinetic models for Pseudomonas fulva in fresh-cut lettuce at different temperatures

表3 鮮切生菜中熒光假單胞菌的生長動力學(xué)參數(shù)Table 3 Growth kinetics parameters of Pseudomonas fulva on fresh-cut lettuce

圖2 溫度與最大比生長速率（μmax）和遲滯時間（λ）的關(guān)系Fig.2 Relationship between temperature and maximum specific growth rate（μmax） and lag time（λ）

表4 鮮切生菜在7℃和15℃貯藏時熒光假單胞菌的實測值和預(yù)測值Table 4 Predicted and observed values of Pseudomonas fulva on fresh-cut lettuce stored at 7℃and 15℃

表5 鮮切生菜在7℃和15℃貯藏條件下熒光假單胞菌生長預(yù)測值的偏差度和準(zhǔn)確度Table 5 Bias and accuracy factor of predicted values of Pseudomonas fulva on fresh-cut lettuce stored at 7℃and 15℃

由準(zhǔn)確度和偏差度可知，本研究建立的預(yù)測模型對不同溫度貯藏條件下鮮切生菜中熒光假單胞菌的生長情況預(yù)測效果良好。

2.5 剩余貨架期的預(yù)測和驗證

根據(jù)2.1可知鮮切生菜的最小腐敗量為6.9663 lg（cfu/g），最大菌數(shù)根據(jù)表3不同溫度貯藏條件下最大菌數(shù)對數(shù)值的平均值8.182 7 lg（cfu/g）為指標(biāo)。根據(jù)建立的優(yōu)勢腐敗菌生長動力學(xué)模型，應(yīng)用鮮切生菜初始熒光假單胞菌數(shù)量（N0）、最小腐敗量（Ns）和最大菌數(shù)（Nmax）建立剩余貨架期，即從初始微生物數(shù)量增值到最小腐敗量所需要的時間，鮮切生菜剩余貨架期模型為：

將貯藏在7℃和15℃條件下鮮切生菜的貨架期和鮮切生菜貨架期預(yù)測模型預(yù)測的貨架期進行比較，對鮮切生菜剩余貨架期預(yù)測模型進行驗證。

表6是鮮切生菜在7℃和15℃條件下貯藏時貨架期實測值和預(yù)測值的對比結(jié)果，相對誤差分別為-12.53%和8.65%。研究表明，食品微生物預(yù)測模型誤差在±25%以內(nèi)的模型即可作為可靠的預(yù)測工具。因此，本試驗所建立的鮮切生菜剩余貨架期的預(yù)測模型具有較好的可靠性，能夠有效的預(yù)測鮮切生菜的剩余貨架期。

表6 鮮切生菜在7℃和15℃貯藏時貨架期的實測值和預(yù)測值Table 6 Predicted and observed shelf life for fresh-cut lettuce stored at 7℃and 15℃

3 結(jié)語

應(yīng)用Gompertz模型建立了不同溫度條件貯藏鮮切生菜熒光假單胞菌的生長曲線和模型。

0 ℃：N （t）=4.431 4+3.135exp{-exp[0.015 2×(40.528-t)+1]}

4 ℃：N（t）=4.431 4+3.01exp{-exp[0.018×(29.254 7-t)+1]}

10 ℃：N（t）=4.431 4+3.828exp{-exp[0.045 5×(7.535 1-t)+1]}

25 ℃：N （t）=4.431 4+5.032{-exp[0.117 4×(2.385-t)+1]}

應(yīng)用Belehradek模型建立了溫度對鮮切生菜中熒光假單胞菌最大比生長速率和遲滯時間的關(guān)系，方程分別為：

根據(jù)建立的鮮切生菜中熒光假單胞菌的生長動力學(xué)模型求的7℃和15℃貯藏時的預(yù)測值，與相應(yīng)溫度下熒光假單胞菌的實際檢測值對比來對模型進行驗證，準(zhǔn)確度和偏差度分別為1.014 9、0.995 9和1.005 6、1.002 3，建立的預(yù)測模型可以很好的預(yù)測鮮切生菜中熒光假單胞菌在7℃和15℃下的生長動態(tài)。

根據(jù)建立的優(yōu)勢腐敗菌生長動力學(xué)模型，建立了鮮切生菜的剩余貨架期的預(yù)測模型：

將貯藏在7℃和15℃條件下鮮切生菜的貨架期實際值和預(yù)測值對比，相對誤差分別為-12.53%和8.65%，表明所建的鮮切生菜貨架期預(yù)測模型能夠真實有效地預(yù)測鮮切生菜的剩余貨架期。

目前，在畜肉、水產(chǎn)品等食品冷鏈流通領(lǐng)域中[21-22]，已有應(yīng)用特定腐敗菌生長預(yù)測模型預(yù)測產(chǎn)品剩余貨架期的研究報道，但是在鮮切生菜中的應(yīng)用報道較少。有研究對酸性電解水處理鮮切生菜及氣調(diào)包裝鮮切生菜中需氧細菌、大腸桿菌類、蠟樣芽孢桿菌、菌落總數(shù)等進行了動力學(xué)方面的研究[23-24]。唐堅[25]采用Gompertz模型建立了貯藏期間生菜的微生物生長模型方程，在一級模型的基礎(chǔ)上得到了低溫下的貨架期預(yù)測模型。張立奎等[26]研究了鮮切生菜在不同貯藏溫度下鮮切生菜中菌落總數(shù)的變化，建立了相應(yīng)的Gompertz函數(shù)模型。本研究建立了鮮切生菜的剩余貨架期模型，為鮮切生菜貨架期的快速預(yù)測奠定基礎(chǔ)。同時，本研究僅建立了鮮切生菜中熒光假單胞菌的溫度預(yù)測模型，建議下一步研究包含更多自變量的預(yù)測模型，同時采集更多的生長數(shù)據(jù)，為鮮切生菜建立更準(zhǔn)確更可靠的貨架期預(yù)測模型。