pH響應(yīng)型透明質(zhì)酸膠束的制備及其藥物傳遞性能

宋家鴻， 徐珊珊， 張曼悅， 劉 瀟， 許菲格， 朱棟琪， 陳荊曉， 陳敬華

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

用聚合物膠束包載疏水性抗腫瘤藥物能夠有效增加藥物溶解性，并能利用納米粒子獨特的增強滲透滯留（EPR）效應(yīng)，改善藥物在體內(nèi)的分布，提高藥物在腫瘤組織中的蓄積，提高治療效果并且降低毒副作用[1-5]。利用腫瘤細胞表面異常過表達的抗原及受體，在納米粒子表面修飾對應(yīng)的抗體和配體，可進一步提高納米粒子對腫瘤細胞的選擇性，實現(xiàn)主動靶向治療[6-8]。

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是一種生物相容性良好的天然糖胺聚糖，能夠識別多種腫瘤細胞表面過表達的CD44受體[9-11]，因而廣泛用于構(gòu)建藥物載體。有研究表明，苯硼酸在弱堿性環(huán)境下可與含1，2-二醇結(jié)構(gòu)的多糖形成酸敏感硼酸酯鍵。由于腫瘤部位具有pH偏低的特點，因而可以用硼酸酯鍵制備pH-敏感型藥物載體[12-14]。

作者以HA為親水性主鏈，硼酸衍生化脫氧膽酸（Boronate modified deoxycholic acid，AD）為疏水基團，基于硼酸酯鍵制備兩親性材料HAAD，進而通過自組裝制備膠束用于DOX的包載和靶向傳遞見圖1。利用腫瘤細胞表面過表達的CD44受體和腫瘤組織偏酸的性質(zhì)，實現(xiàn)載藥膠束對藥物的靶向傳遞以及快速釋放，提高治療效果。

圖1 HAAD的合成路線Fig.1 Synthesis routes of HAAD conjugate

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 HA（相對分子質(zhì)量5 000）：購自山東華熙福瑞達醫(yī)藥集團公司；氨基苯硼酸（APBA）：購自上海安耐吉化學(xué)有限公司；脫氧膽酸（DOCA）和三乙胺（TEA）：購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDAC）和 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：購自阿拉丁試劑有限公司；阿霉素·鹽酸鹽 （DOX·HCl）：購自浙江海正制藥有限公司；胰酶：購自Sigma-Aldrich公司；DMEM細胞培養(yǎng)基：購自Life Technologies公司；胎牛血清（FBS）：購自 Hyclone 公司；其它試劑均為分析純，使用前純化。

1.1.2 儀器 Avance III型核磁共振波譜儀：德國Bruker公司制造；JEM-2100透射電鏡：日本JEOL公司制造；Zetasizer Nano ZS電位及粒度分析儀：英國Malvern公司制造；Multiskan GO酶標儀：美國Thermo公司制造；DMIL倒置熒光顯微鏡：德國Leica公司制造；FACScan流式細胞儀：美國BD公司制造。

1.1.3 細胞 人乳腺癌細胞（MCF-7）和非洲綠猴腎成纖維細胞 （COS7）：購自中國科學(xué)院保藏中心（上海）。

1.2 方法

1.2.1 AD的制備 稱取的 DOCA（1 g，2.55 mmol）溶于5 mL新蒸DMF中，于冰浴下加入EDAC（474 mg，3.06 mmol）和 NHS（351 mg，3.06 mmol）攪拌 1 h活化羧基，然后將 APBA（263 mg，1.70 mmol）加入上述溶液并在氮氣保護下于室溫攪拌反應(yīng)24 h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液濃縮并用去離子水沉淀，過濾收集產(chǎn)生的黃色沉淀，并通過堿性氧化鋁柱層析分離獲得 AD（二氯甲烷∶甲醇=10∶1），通過核磁共振氫譜驗證結(jié)構(gòu)。

1.2.2 HAAD的制備 稱取100 mg的HA溶于6 mL甲酰胺，將3 mL含有263.4 mg AD的DMF溶液（MAD∶M雙糖=4∶1）加入到上述溶液中，并調(diào)節(jié)溶液pH為10.0，之后置于室溫下反應(yīng)24 h。待反應(yīng)結(jié)束后用pH 10.0的緩沖液透析1 d去除有機溶劑，冷凍干燥后用DMSO洗去未反應(yīng)的AD，再次干燥得到產(chǎn)品。通過核磁共振氫譜驗證結(jié)構(gòu)并計算AD的取代度。根據(jù)AD標曲測定其含量，AD含量 （%）=（WAD/WHAAD）×100。

1.2.3 載藥HAAD膠束的制備 稱取6 mg的DOX·HCl溶于1 mL甲酰胺中，并加入1 mL TEA，避光攪拌過夜脫除鹽酸鹽。然后將其加入到5 mL含有30 mg HAAD的甲酰胺溶液中，避光攪拌1 h。最后將其裝入透析袋（相對分子質(zhì)量3 500）避光透析24 h，冷凍干燥獲得載藥HAAD膠束。

1.2.4 HAAD膠束的表征 將HAAD和載藥HAAD溶于PBS中（pH 7.4），配制成1 mg/mL的溶液，通過粒徑儀測定它們的粒徑分布以及ζ-電位，并用透射電鏡觀察其形貌。

1.2.5 載藥量和包封率的測定 通過掃描阿霉素在有機試劑（V甲酰胺∶VDMF=2∶1）和 PBS 中的全波長，發(fā)現(xiàn)其分別在480 nm和497 nm處有最大吸收[15]。用梯度稀釋法測量不同DOX質(zhì)量濃度下吸光值后，以阿霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值（A）為縱坐標，經(jīng)過擬合后繪制阿霉素在有機試劑和PBS中的標準曲線。線性回歸方程式為：

其中，式（1）為阿霉素在PBS中的標準曲線，式（2）為阿霉素在甲酰胺/DMF（V/V=2∶1）中的標準曲線。

將載藥HAAD膠束溶于甲酰胺/DMF（V/V=2∶1）中，質(zhì)量濃度0.05 mg/L，測定其在480 nm處的吸光值。

1.2.6 體外藥物釋放實驗 將4 mL載藥HAAD膠束（1 mg/mL）分成兩組，分別裝入透析袋（相對分子質(zhì)量3 500）中，浸沒于 5 mL PBS中（pH 7.4和pH 5.0）。在37℃、200 r/min搖床下進行藥物釋放實驗，每隔一定時間取樣，測其在497 nm下的紫外吸光值，同時更換新鮮PBS，每組實驗3個平行。

1.2.7 體外細胞毒性實驗 將COS7細胞和MCF-7細胞以每孔8 000個細胞接種于96孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，分別加入不同質(zhì)量濃度的載藥HAAD膠束，空白HAAD膠束和游離DOX，培養(yǎng)48 h后用噻唑藍（MTT）比色法測定其在570 nm下的吸光（OD）值，計算細胞存活率。

1.2.8 細胞攝取實驗 將COS7細胞和MCF-7細胞以每孔3×104個細胞接種于24孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，加入等阿霉素量的載藥HAAD膠束和游離DOX（質(zhì)量濃度1 μg/mL），3 h后移去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后用4%的多聚甲醛溶液固定15 min，吸去多聚甲醛后加入200 μL的 DAPI（200 ng/mL）溶液孵育 15 min，PBS 充分洗滌后用熒光倒置顯微鏡觀察。

1.2.9 流式細胞儀分析 將COS7細胞和MCF-7細胞以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，加入等阿霉素量的載藥HAAD膠束和游離DOX（質(zhì)量濃度1 μg/mL），3 h后移去培養(yǎng)基，將細胞收集于500 mL PBS中，用流式細胞儀分析細胞內(nèi)DOX的熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HAAD的制備

AD的核磁共振氫譜見圖2。與圖2（a）相比較，圖2（b）中7.19～7.89處出現(xiàn)了APBA上苯環(huán)的峰，7.94處出現(xiàn)了酰胺鍵的峰，而11.87處DOCA上羧基的峰消失了，這說明AD已經(jīng)成功制備。另外，HAAD 的核磁圖譜（圖 3）在 0.71～1.94和 7.0～8.0處分別出現(xiàn)了DOCA甾環(huán)和苯環(huán)的特征峰，通過263 nm處的AD標曲計算得出每100個雙糖分子含有27個AD分子，見圖3。

圖2 DOCA（a）與AD（b）在DMSO中的核磁共振氫譜Fig.2 1H-NMR of（a） DOCA and（b） AD in DMSO

圖3 HAAD在D2O/DMSO（V/V:1/1）中的核磁共振氫譜Fig.3 1H-NMR of HAAD in D2O/DMSO（V/V:1/1）

2.2 納米粒子的表征

由于疏水性抗腫瘤藥物阿霉素被包裹于膠束核心內(nèi)，因此通過動態(tài)光散射測得的HAAD膠束的粒徑由載藥前的171 nm增大到246 nm，見圖4。透射電鏡觀察到HAAD膠束為均勻分散的球狀結(jié)構(gòu)，見圖5。由于電鏡觀測的是干燥狀態(tài)下的膠束，其平均尺寸要小于DLS測得的水合粒徑。另外，HAAD膠束的ζ-電位為-23 mV，這表明膠束表面帶有負電荷，并且ζ-電位絕對值較大，說明其具有良好的穩(wěn)定性。由于膠束表面帶負電，因而還可以有效避免血漿蛋白的吸附，延長血液循環(huán)時間。

圖4 HAAD與載藥HAAD的粒徑分布及ζ-電位Fig.4 Size distributions and ξ-potential of HAAD and DOX-loaded HAAD

圖5 HAAD膠束的透射電鏡圖Fig.5 TEM image of HAAD micelles

2.3 體外藥物釋放

載藥HAAD膠束的載藥量（DL）和包封率（EE）分別測得為9.15%和45.74%，說明該載體有較良好的載藥能力。體外藥物釋放實驗分別在pH 7.4和pH 5.0的PBS中進行，pH 7.4用于模擬體內(nèi)正常組織環(huán)境，而pH 5.0則用于模擬腫瘤組織微環(huán)境。如圖6所示，在pH 5.0組中，HAAD的藥物釋放速率相對較快，在初始的10 h內(nèi)累積釋放藥物63.86%，48 h后達到86.61%。而在pH 7.4組中，10 h和48 h的累積藥物釋放率分別為40.59%和66.01%。產(chǎn)生這一差異的主要原因是在酸性環(huán)境下，HAAD膠束的硼酸酯鍵會斷裂，導(dǎo)致HA與AD解離，而造成藥物快速泄漏。另一方面，阿霉素在酸性pH下較好的溶解性也使得阿霉素能夠更快地從透析袋內(nèi)部擴散到外部。這一結(jié)果證明了HAAD膠束可以實現(xiàn)在腫瘤內(nèi)部的pH-敏感性釋放。

圖6 HAAD在pH 7.4和pH 5.0環(huán)境下的體外藥物釋放Fig.6 In vitro drug release profiles of HAAD at pH 7.4 and pH 5.0

2.4 體外細胞毒性

良好的生物相容性是藥物載體的必要條件之一，作者研究了空白膠束載體對COS7和MCF-7細胞的細胞毒性。如圖7所示，由于APBA被包裹在膠束核心內(nèi)部，APBA與HA形成的硼酸酯鍵避免了硼酸與細胞的直接接觸，減小了硼酸的毒性，因此空白HAAD膠束即使質(zhì)量濃度達到300 mg/L時，細胞存活率仍然超過了80%，這表明所制備的材料具有較好的生物相容性。

圖7 HAAD對MCF-7細胞和COS7細胞48 h的體外細胞毒性Fig.7 In vitro cytotoxicity of HAAD against MCF7 and COS7 cells after 48 h

載藥HAAD膠束的細胞毒性見圖8。對于MCF-7細胞，載藥HAAD膠束與DOX對細胞的半數(shù)致死量（IC50）分別為0.37 mg/L和0.31 mg/L。由于HA能夠有效識別MCF-7細胞表面過表達的CD44受體，增加了MCF-7細胞對載藥膠束的攝取量，并在MCF-7細胞內(nèi)部酸性環(huán)境下，硼酸酯鍵發(fā)生水解并釋放出包載的DOX，對細胞的生長產(chǎn)生了抑制作用，因此載藥HAAD膠束展現(xiàn)了與DOX相似的細胞毒性。而對于COS7細胞，載藥HAAD膠束對細胞的半數(shù)致死量要遠大于DOX。這是因為COS7細胞表面不具有過表達的CD44受體，因而HAAD膠束被細胞攝取的量相對較低，因而膠束對COS7細胞抑制毒性相對較小。

2.5 細胞攝取

載藥HAAD膠束和游離DOX與細胞共培養(yǎng)3 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞對HAAD的攝取情況。如圖9所示，紅色熒光為DOX，藍色熒光為細胞核，a為MCF-7細胞對載藥膠束的攝取圖，b為MCF-7細胞對游離阿霉素的攝取圖，c為COS7細胞對載藥膠束的攝取圖，d為COS7細胞對游離阿霉素的攝取圖。在CD44過表達的MCF-7細胞中，可以觀察到與游離DOX組同樣強烈的紅色熒光，而在CD44非過表達的COS7細胞中，HAAD膠束組的紅色熒光要遠遠弱于游離DOX組。為了更加直觀地表現(xiàn)載藥HAAD膠束在MCF-7細胞和COS7細胞中攝取量的差異，使用流式細胞儀對細胞攝取情況進行了定量分析，結(jié)果見圖10。與載藥HAAD膠束共同孵育3 h后，MCF-7細胞內(nèi)的熒光強度要明顯強于COS7細胞，說明載藥HAAD膠束可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被CD44過表達的乳腺癌細胞有效攝取，從而抑制腫瘤細胞的生長，而對于COS7這樣的正常細胞，載藥HAAD膠束并不能被有效攝取，所以其對COS7細胞的毒性要遠小于游離阿霉素，這與細胞毒性的結(jié)果相符。

圖8 載藥HAAD對 （a）MCF-7細胞和 （b）COS7細胞48 h的體外細胞毒性Fig.8 In vitro cytotoxicity of DOX-loaded DOX against（a） MCF7 cells and（b） COS7 cells after 48 h

3 結(jié) 語

本研究成功制備了具有酸敏感的兩親性材料HAAD，其在水溶液中可以自組裝形成大小均一、分散性良好、表面帶有負電荷的球形膠束。載藥HAAD膠束在酸性環(huán)境中由于硼酸酯鍵斷裂會造成膠束的解離并快速釋放出阿霉素，表現(xiàn)出pH響應(yīng)的釋藥行為。此外，膠束能夠靶向識別CD44受體過表達的MCF-7細胞，從而增強細胞攝取效率，而對正常的COS7細胞毒性較小，體現(xiàn)了藥物傳遞的選擇性，這種敏感靶向型膠束在臨床應(yīng)用方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

圖 9 載藥 HAAD，DOX 與 （a，b） MCF-7 細胞和（c，d）COS7細胞共培養(yǎng)3 h的熒光照片F(xiàn)ig.9 Fluorescent images of（a，b） MCF-7 cells and（c，d）COS7 co-cultured with DOX and DOX-loaded micelles for 3 h

圖10 3 h時流式細胞儀分析HAAD被（a）MCF-7和（b）COS7細胞攝取的結(jié)果Fig.10 Flow cytometry analysis of HAAD uptake by（a）MCF7 and（b） COS7 cells at 3h