擬粉紅鎖擲孢酵母降解展青霉素的蛋白質(zhì)組學(xué)

趙利娜， 孫藝文， 張曉云， 張紅印

（江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

展青霉素（Patulin，PAT）又稱棒曲霉素，是一種主要由曲霉屬、青霉屬等產(chǎn)生的有毒的真菌次級代謝產(chǎn)物，主要污染水果及其衍生制品。食用受展青霉素污染的食物和飲料嚴(yán)重威脅人類的健康[1]，其可以氧化損傷人類細(xì)胞導(dǎo)致致突變性[2]、細(xì)胞毒性[3]、致畸性[4]以及遺傳毒性[5]等。食品生產(chǎn)中展青霉素的污染十分普遍，廣泛存在于桔子、蘋果、梨、菠蘿、玉米以及谷物等產(chǎn)品中，特別是在蘋果及其制品中展青霉素的污染最為嚴(yán)重。

PAT是對人類危害最大的真菌毒素之一[6]，可以引起一些急慢性病癥及細(xì)胞水平病癥。動物試驗表明，小鼠在注射PAT后會導(dǎo)致皮下組織水腫、呼吸困難、肺充血等急性癥狀。大劑量的PAT還具有致畸性、免疫毒性、致突變性及遺傳毒性。其細(xì)胞毒性是由于PAT能改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致K+過度流失，抑制大分子物質(zhì)合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性喪失。食品中污染PAT嚴(yán)重威脅著人類的健康，相關(guān)機(jī)構(gòu)已嚴(yán)格限制其含量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟規(guī)定果汁、果酒（僅以蘋果和山楂為原料制成的產(chǎn)品）中PAT的最高限量為50 μg/L，固體蘋果產(chǎn)品及其制品中PAT的最高限量為25 μg/L，而嬰幼兒食品中PAT的最高限量為 10 μg/L[7]；美國食品藥品管理局（FDA）規(guī)定蘋果及其制品中PAT的含量不得高于50 μg/kg[8]；蘋果及其制品中PAT的限量標(biāo)準(zhǔn)在我國國標(biāo)中是50 μg/L[9]。因此，控制食品中的PAT，尤其是控制蘋果及其制品中PAT的污染，具有十分重要的衛(wèi)生學(xué)意義。

控制蘋果中PAT污染的傳統(tǒng)方法是使用化學(xué)合成殺菌劑。然而，隨著化學(xué)殺菌劑的持續(xù)和大量使用，病原體逐漸產(chǎn)生了抗藥性，不僅防治效力降低，而且化學(xué)殘留也會對食物造成污染。因此，人們迫切需要尋求可替代化學(xué)殺菌劑的安全、高效、環(huán)保的新方法。近年來國內(nèi)外的研究表明，部分酵母菌可以直接抑制PAT的產(chǎn)生，有的甚至可以降解PAT。例如：膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）[10-11]、卡利畢克畢赤酵母（Pichia caribbica）[12]、紅冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）[13]等拮抗菌均能不同程度地控制和降解PAT。Castria等[14]的研究表明，初始質(zhì)量濃度為100 μg/mL的PAT分別與膠紅酵母 （R.glutinis）和羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）共同培養(yǎng)10 d后，發(fā)現(xiàn)PAT的質(zhì)量濃度分別降低了82%和47%。Zhu等[15]的研究表明，R.paludigenum可以降低蘋果體內(nèi)PAT的含量，同時在體外實驗中初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的PAT與酵母培養(yǎng)3 d后已完全檢測不到。

作者所在課題組從江蘇省鎮(zhèn)江市江心洲有機(jī)果園篩選得到一株對蘋果及葡萄具有高效生物防治效力的酵母菌[16]，經(jīng)鑒定為擬粉紅鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus Y16）。初步試驗發(fā)現(xiàn)該酵母菌不僅能夠降低蘋果由擴(kuò)展青霉引起的青霉病的發(fā)病率，同時還能夠降低蘋果傷口處PAT的積累，并且在體外能夠降解PAT[17]，但具體的降解機(jī)制尚不明確。作者擬利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對擬粉紅鎖擲孢酵母體外降解PAT的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，不僅可以為拮抗菌降解PAT的研究提供一定的理論依據(jù)，也將有助于推動生物法控制及降解PAT的實際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Ettan IPGhor等電聚焦儀、SDS-PAGE電泳儀、Image Scanner掃描儀：美國GE Healthcare公司；UltrafleXtrem MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀：美國Bruker Daltonics公司；TS-A型脫色搖床：金壇市中大儀器廠；PHS-3BW酸度計：上海理達(dá)儀器廠；UV-6100A型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；GR85DR型全自動高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；恒溫?fù)u床：太倉市強(qiáng)樂試驗設(shè)備廠產(chǎn)品；電子顯微鏡：江南光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；血球計數(shù)板：購自丹陽市健陵醫(yī)療器械公司。

1.2 酵母菌

酵母菌S.pararoseus Y16：作者所在課題組分離鑒定并保存的菌種，于NYDA培養(yǎng)基（酵母浸膏5 g，牛肉膏 8 g，葡萄糖 10 g，瓊脂 20 g，無菌水定容至1 L后滅菌）中4℃保存，經(jīng)NYDB培養(yǎng)基（酵母浸膏5 g，牛肉膏 8 g，葡萄糖10 g，無菌水定容至1 L）活化（28 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng) 20 h）后，7 500 r/min離心10 min，無菌水洗滌兩次，用無菌水重新懸浮酵母細(xì)胞，血球計數(shù)法計數(shù)并用無菌水調(diào)至所需濃度。

1.3 總蛋白質(zhì)的提取

經(jīng)活化后的S.pararoseus Y16用無菌水調(diào)整其濃度為1×108個/mL，在20 mL NYDB培養(yǎng)基中加入1 mL S.pararoseus Y16菌懸液，分兩組處理：一組添加終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的PAT儲備液，另一組添加無菌水作為對照，于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)18 h，4 ℃、10 000 r/min 離心 10 min，并用預(yù)冷的無菌水洗滌兩次。將菌體加入液氮快速研磨，把菌體粉末倒入50 mL離心管中，加入10 mL TE緩沖液（50 mmol/L），再加入 174 μL 質(zhì)量濃度為 10 mg/mL的PMSF溶液。加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的RNase A 和 200 μg/mL的 DNase，充分振蕩，置于冰上靜置30 min。于4℃、10 000 r/min離心20 min，取全部上清液，加入2倍體積20%TCA/丙酮溶液（預(yù)冷），充分振蕩混勻，-20 ℃沉淀過夜（12～16 h）。上下顛倒混勻，于4℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清液，之后用預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀2次。沉淀移至1.5 mL EP管，再加入1 mL丙酮清洗沉淀兩次，棄上清液，13 000 r/min離心2 min，置于冰上風(fēng)干。加入200 μL裂解液溶解蛋白質(zhì)，并用移液槍不斷吹打促溶（冰上）。若蛋白質(zhì)含量較高，可增加裂解液用量，或相應(yīng)延長裂解時間。用Barford法[18]測定蛋白質(zhì)濃度后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙向電泳

IPG膠條的水化上樣：將-20℃保存的IPG（24 cm，pH 3～10）膠條取出，室溫放置 30 min。 將水化緩沖液置于室溫融化，加入2.8 mg DTT和5 μL IPG緩沖液（pH 3～10），充分混勻。蛋白質(zhì)上樣量為3 mg，與適量水化液吹打混勻，總體積為450 μL。把泡漲盤放入IPG box，樣品均勻點到盤中。去掉膠條保護(hù)膜，緩緩放到膠條槽中，膠面正對蛋白質(zhì)樣品（避免氣泡），保持IPG box水平，室溫水化 12～16 h。

第一向等電聚焦 （IEF）：水化結(jié)束后，將IPG box中的IPG膠條轉(zhuǎn)移至聚焦盤中，膠面朝上，使膠條上的正極對應(yīng)于聚焦盤上的正極。在膠條兩端加蓋濾紙片，濾紙片的三分之一壓住膠條。將電極絲卡住濾紙片，在膠條上覆蓋石蠟油之后，合上蓋子。設(shè)置IPGphor等電聚焦程序。每根膠條的最大電流50 μA，聚焦溫度20℃。等電聚焦參數(shù)設(shè)置為：①100 V，快速 1 h；②200 V，快速 2 h；③500 V，快速 1 h；④100 V，慢速 2 h；⑤10 000 V，慢速 3 h；⑥10 000 V，快速 6.5 h；⑦500 V，快速 15 h。

第二向SDS-PAGE電泳：配制12.5%的SDSPAGE凝膠。按照GE說明書組裝灌膠模具，灌膠后每塊膠加入1 mL飽和正丁醇封膠。凝膠凝固后將聚焦結(jié)束后的膠條取出，濾紙吸去多余的礦物油。置于泡漲盤中進(jìn)行平衡，每兩根膠條加入10 mL平衡緩沖液I（含0.1 g DTT），將泡漲盤置于水平搖床上，平衡15 min。結(jié)束后倒掉多余的平衡液，再等體積加入10 mL平衡緩沖液II（含0.25 g IAM），步驟同第一次平衡。將IPG膠條取出，浸泡于1×電泳緩沖液中。待SDS-PAGE凝膠完全凝固后，將凝膠固定于電泳架上。將低熔點瓊脂糖用移液器加入到凝膠上部，將膠條置于凝膠上表面，使其充分貼合，同時避免結(jié)合處產(chǎn)生氣泡。轉(zhuǎn)入電泳槽進(jìn)行第二向蛋白質(zhì)電泳。打開電泳儀，循環(huán)水溫度17℃，電泳程序1 W/膠條，運行約60 min，待藍(lán)色條帶進(jìn)入凝膠后，電壓增加到15 W/膠條，待藍(lán)色條帶距離底部1 cm時關(guān)閉電泳設(shè)備。將凝膠小心轉(zhuǎn)移到染色托盤中。加入適量的染色液置于染色盒中，在水平搖床上室溫染色2～3 h。染色結(jié)束后，用雙蒸水沖洗凝膠，加入脫色液，脫色直至蛋白質(zhì)點清晰為止。將凝膠掃描分析或4℃保存于7%冰醋酸溶液。

1.5 凝膠圖譜分析及質(zhì)譜實驗操作流程

凝膠使用ImageScannerIII掃描儀進(jìn)行掃描，分辨率600 dpi。使用ImageMaster 7.0軟件對凝膠上的蛋白點進(jìn)行分析。根據(jù)分析結(jié)果將蛋白質(zhì)點從凝膠上切下，用蒸餾水洗兩次。用NH4HCO3/乙腈（100 mmol/L）脫色，清晰至透明，去除上清液。用乙腈（100%）脫水2次，每次5 min，得到白色膠粒。加入5 μL 胰酶（10 ng/μL）置于 4 ℃中 30～60 min，加入20 μL NH3HCO3（25 mmol/L）緩沖液，37 ℃ 水浴反應(yīng)過夜。上清液經(jīng)真空冷凍干燥后，用于蛋白質(zhì)MS分析。樣品使用UltrafleXtrem MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。

1.6 蛋白質(zhì)鑒定

肽指紋圖譜信息通過FlexAnalysis軟件和BioTools軟件進(jìn)行分析。質(zhì)譜結(jié)果利用Mascot本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，搜索參數(shù)為：NCBInr真菌數(shù)據(jù)庫，酶類是胰蛋白酶，Peptide tol為±0.3，半胱氨酸的氨酰甲基化及甲硫氨酸的氧化修飾。鑒定結(jié)果利用MASCOT的 Mowse score。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬粉紅鎖擲孢酵母蛋白質(zhì)雙向電泳圖

S.pararoseus Y16在未添加PAT和添加PAT的NYDB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)18 h后，收集酵母細(xì)胞提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠雙向電泳，見圖1。通過ImageMaster 7.0分析后，結(jié)果表明，添加PAT和未添加PAT的NYDB培養(yǎng)基中S.pararoseus Y16共檢測出236個蛋白質(zhì)點，97種蛋白質(zhì)表達(dá)量有顯著性差異，其中68個上調(diào)蛋白質(zhì)，29個下調(diào)蛋白質(zhì)，集中對30種高峰度差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。MS/MS質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)提交Mascot。30個蛋白質(zhì)點中有5個沒有與數(shù)據(jù)庫中相匹配的信息，鑒定需要進(jìn)一步確定。

2.2 PAT誘導(dǎo)S.pararoseus Y16蛋白質(zhì)差異點質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表1簡述了30個差異蛋白質(zhì)點的相對分子質(zhì)量、等電點等基本情況。大多數(shù)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)與基礎(chǔ)代謝有關(guān)，還包括一些環(huán)境脅迫下產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，以及多種假設(shè)蛋白 （點7，13，17，20，25，26）。 結(jié)果表明 PAT 可以激活 S.pararoseus Y16的基礎(chǔ)代謝，引起細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，由于差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與了多種代謝途徑，所以S.pararoseus Y16對PAT的反應(yīng)機(jī)制是復(fù)雜的。

2.3 差異蛋白質(zhì)的GO分析

質(zhì)譜結(jié)果在Mascot數(shù)據(jù)庫比對得到蛋白質(zhì)的基因 ID，通過 Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）找到蛋白質(zhì)相應(yīng)的GO ID。根據(jù)差異蛋白質(zhì)的GO ID使用Notepad++軟件對蛋白質(zhì)GO信息進(jìn)行分類。蛋白質(zhì)的GO信息分為生物過程（Biological process）、分子功能（Molecuar function）、細(xì)胞組分（Celluar component）三大功能。對未添加PAT和添加PAT培養(yǎng)導(dǎo)致的 S.pararoseus Y16細(xì)胞差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO富集分析，見圖2。由圖2可知，差異蛋白質(zhì)主要涉及生物過程和細(xì)胞組分，少數(shù)與分子功能相關(guān)。涉及到主要的10種生物過程中參與最多的是細(xì)胞過程和代謝過程，其次是應(yīng)激反應(yīng)、生物體調(diào)節(jié)過程、生物附著、色素沉積等；差異蛋白質(zhì)參與的細(xì)胞組成主要包括：細(xì)胞組分合成、大分子配合物合成、細(xì)胞器組成及膜封閉腔的形成等；在分子功能中，差異蛋白質(zhì)主要參與結(jié)合作用、催化作用、電子載體和結(jié)構(gòu)分子。

圖1 未添加PAT和添加PAT的NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的S.pararoseus Y16蛋白質(zhì)雙向電泳圖Fig.1 Two-dimensional pattern of intracellular proteins of S.pararoseus Y16 after cultivation in NYDB or NYDB amended with PAT

表1 未添加PAT和添加PAT的NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的S.pararoseus Y16差異蛋白質(zhì)譜肽段在Moscot中的分析結(jié)果Table 1 Identification of cellular proteins of S.pararoseus Y16 showing differential expression after cultivation in NYDB or NYDB amended with PAT using MS/MS analysis

續(xù)表1

圖2 未添加PAT和添加PAT對S.pararoseus Y16細(xì)胞差異蛋白質(zhì)GO分析Fig.2 GO categorization of S.pararoseus Y16 showing differential expression after cultivation in NYDB or NYDB amended with PAT

3 結(jié) 語

蛋白質(zhì)圖譜經(jīng)過IPM7.0軟件分析，添加PAT和未添加PAT條件下的S.pararoseus Y16細(xì)胞大約檢測出總蛋白質(zhì)236個，97種蛋白質(zhì)表達(dá)量有顯著性差異，其中68個上調(diào)蛋白質(zhì)，29個下調(diào)蛋白質(zhì)，對其中30種高峰度差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定。差異蛋白質(zhì)涉及少數(shù)抗性相關(guān)蛋白質(zhì)及多種基礎(chǔ)代謝相關(guān)的酶，包括氨基酸、糖類及能量代謝，說明S.pararoseus Y16在降解PAT的過程中，能增強(qiáng)一些與自身基礎(chǔ)代謝及環(huán)境脅迫相關(guān)的酶，而這些酶可能與降解PAT的機(jī)制有關(guān)。對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分析可知，差異蛋白質(zhì)的功能主要包括：細(xì)胞基礎(chǔ)代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)途徑、應(yīng)激反應(yīng)等。

研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到很大環(huán)境壓力時，它的第一反應(yīng)就是合成更多的熱休克蛋白 （Heat shock protein，HSP）。HSP是一種重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白質(zhì)，可以保護(hù)基本生理過程中不可或缺的蛋白質(zhì)，還能分解受損蛋白質(zhì)，回收合成蛋白質(zhì)的原材料，維持免疫細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，將細(xì)胞內(nèi)正常的生理生化過程維持在穩(wěn)定狀態(tài)[19-20]。當(dāng)病原菌等抗原激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答時，免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可誘導(dǎo)生成熱休克蛋白，其可協(xié)同免疫細(xì)胞完成一系列的應(yīng)答過程[21]。圖1顯示，PAT可以刺激S.pararoseus Y16細(xì)胞中Heat shock 70 000 protein（HSP70）（點 8）和 Heat shock protein sks2（點2）表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)細(xì)胞對環(huán)境的適應(yīng)能力，啟動免疫應(yīng)答，維持細(xì)胞的正常生命活動，由此推測HSP是S.pararoseus Y16降解PAT過程中重要的參與酶之一。

果糖二磷酸醛縮酶 （Fructose-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BA）（點 21）是植物中參與糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶。Cai等[22]的研究表明，F(xiàn)BA基因在生物和非生物的脅迫反應(yīng)中具有重要的作用，并調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育，而番茄FBA家族的擴(kuò)增結(jié)果也表明，F(xiàn)BA基因參與了對低溫和高溫脅迫的響應(yīng)，并能增強(qiáng)種子萌發(fā)中的耐受性。甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶 （mannose-1-phosphate guanylyltransferase，GDP）（點 11） 屬于轉(zhuǎn)移酶家族，參與果糖和甘露糖的代謝。研究表明，GDP可以參與合成甘露糖基甘油酸（Mannosylglycerate，MG），對微生物的滲透壓適應(yīng)和高溫穩(wěn)定性起著重要作用[23]。由圖1可以看出，S.pararoseus Y16在降解PAT的過程中，F(xiàn)BA和GDP均顯著上調(diào)。由此推測S.pararoseus Y16面對PAT造成的環(huán)境脅迫時，F(xiàn)BA及GDP可能促進(jìn)了酵母細(xì)胞的糖類代謝，并且增強(qiáng)了S.pararoseus Y16對環(huán)境的適應(yīng)能力，為PAT的生物降解提供了條件。

除抗性相關(guān)蛋白質(zhì)之外，多種與基礎(chǔ)代謝相關(guān)的酶在S.pararoseus Y16降解PAT的過程中表達(dá)量也顯著上調(diào)。包括1）氨基酸代謝：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）（點 19）催化芳香族氨基酸的合成，以天冬氨酸和酮酸為底物，具有高催化活性。2）脂肪酸代謝：β-酮?；铣擅福╞eta-ketoacyl synthase）（點 23）是催化丙二酰-ACP（malonyl-ACP）與脂肪酸鏈縮合的酶，是許多酶系統(tǒng)的組成部分，包括脂肪酸合成酶 （fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）以及 6-甲基水楊酸合成酶 （6-methysalicylic acid synthase，MSAS），可以催化乙酰輔酶 A（acetyl-CoA），丙二酰輔酶 A（malonyl-CoA）和NADPH形成長鏈脂肪酸，而脂肪酸是機(jī)體的主要能量來源之一。3）TCA循環(huán)：檸檬酸合成酶（citrate synthase，CS）（點 18）是調(diào)控酶，催化 TCA 循環(huán)中的第一步反應(yīng)；產(chǎn)生于糖酵解及細(xì)胞呼吸作用中的檸檬酸循環(huán)；琥珀酸脫氫酶黃素蛋白（succinate dehydrogenase flavoprotein，SDH）（點 15），屬于細(xì)胞色素氧化酶，在TCA循環(huán)中為真核細(xì)胞線粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

此外，還有多種與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)在S.pararoseus Y16與PAT共培養(yǎng)的過程中被誘導(dǎo)或抑制，包括伴侶蛋白 （Chaperonin Cpn60）（點 3），2，5-二酮-葡萄糖酸還原酶（2，5-diketo-D-gluconic acid reductase）（點 22）， 異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase）（點 5），異檸檬酸（裂合）酶（isocitrate lyase，ICL）（點 16） 及假設(shè)的 UDP-葡萄糖異構(gòu)酶（putative UDP-glucose 4-epimerase）（點 30）。

由于研究的局限性，對于鑒定出來的蛋白質(zhì)，只能知道其在代謝過程中的基本功能，而無法驗證其在降解PAT過程中的具體作用，這也是在后續(xù)研究中尚需努力的方面。