敲降胰高血糖素基因?qū)σ葝u素瘤形成的影響

朱國玲，成蘭云，張恒，田浩，門秀麗△

胰島素瘤是功能性胰腺內(nèi)分泌腫瘤中最常見的一種，來源于胰島β細(xì)胞［1-2］，該腫瘤具有較強(qiáng)的自主分泌胰島素能力，并且胰島素的分泌不受低血糖抑制，臨床上常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作并逐漸加重的低血糖，甚至危及生命［3］。長期低血糖不僅可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制癥狀，并且可誘發(fā)大量兒茶酚胺類物質(zhì)釋放入血引起交感神經(jīng)興奮癥狀。因其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，極易引起漏診、誤診和誤治［4-5］，有報(bào)道超過40%的胰島素瘤病例初診為神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?-7］。盡管在過去30年胰島素瘤發(fā)生率有明顯升高［8］，但目前胰島素瘤仍屬于較少見的疑難病癥，對其發(fā)病機(jī)制的了解較少，該類腫瘤的生物學(xué)特性尚有待研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠胰島素瘤既表達(dá)胰島素基因，也表達(dá)胰高血糖素基因［9］，但有關(guān)胰高血糖素基因在胰島素瘤形成中的作用鮮見報(bào)道。本研究擬采用本課題組已經(jīng)成功構(gòu)建的胰島素瘤裸鼠模型［9］，觀察敲降胰高血糖素基因?qū)σ葝u素瘤形成的影響，為進(jìn)一步探討胰島素瘤的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 （1）細(xì)胞。大鼠胰島素瘤細(xì)胞系（INS-1細(xì)胞）、大鼠胰島α細(xì)胞系（INR-1G9細(xì)胞）、INS-1細(xì)胞的單細(xì)胞克?。╮9細(xì)胞）、人胰島素瘤細(xì)胞、293T細(xì)胞、人近端腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2細(xì)胞），上述細(xì)胞系均由中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所婁晉寧教授惠贈。（2）實(shí)驗(yàn)動物。nu/nu裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK（京）2006-0009，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，均為雄性，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下飼養(yǎng)。（3）主要試劑與儀器。1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FCS）均購自美國GIBCO公司，胰蛋白酶、鏈脲佐菌素、氨芐青霉素均購自美國Sigma公司，葡萄糖購自中國大冢制藥有限公司，精氨酸購自上海信誼藥業(yè)有限公司，去甲腎上腺素、乙酰膽堿（TGI）均購自上海禾豐制藥有限公司，胰島素（insulin）ELISA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購自美國Millipore公司，胰高血糖素（glucagon）放射免疫分析試劑盒購自中國原子高科股份有限公司，兔抗insulin多克隆抗體、羊抗glucagon多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒均購自美國Promega公司，BCA法蛋白測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，T4 DNA連接酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，HB101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，pLVTHM-shglucagon慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G由中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所婁晉寧教授惠贈。ELX800自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司，紫外凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，SN-6105γ放射免疫計(jì)數(shù)器購自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司，全自動激光共聚焦顯微鏡1X81購自日本Olympus公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞、INR-1G9細(xì)胞、r9細(xì)胞和人胰島素瘤細(xì)胞用1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清，青霉素/鏈霉素1.0×104U/L，5.5 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES，50μmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L丙酮酸鈉），其中r9細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)另外添加100 mg/L G418；HK-2細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清，青霉素/鏈霉素1.0×104U/L），各種細(xì)胞于5%CO2，37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至融合度為90%時(shí)用0.025%胰蛋白酶/EDTA傳代。

1.3激光共聚焦顯微鏡觀察INS-1細(xì)胞胰島素和胰高血糖素的表達(dá) 將INS-1細(xì)胞（1×105/孔）、人胰島素瘤細(xì)胞（5×104/孔）和HK-2細(xì)胞（5×104/孔）接種于激光共聚焦專用的培養(yǎng)皿中，72 h后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗2次，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，PBS洗2次后，用0.1%Triton X-100+0.1%檸檬酸鈉冰上通透8 min，PBS洗2次后，0.1%BSA/PBS/Tween 20室溫封閉20 min。PBS洗2次，然后用1∶80稀釋的兔抗鼠胰島素抗體4℃孵育過夜。PBS洗2次后，用1∶50稀釋的cy3標(biāo)記的羊抗兔一抗，37℃孵育50 min，PBS洗3次。然后加入1∶80稀釋的羊抗鼠胰高血糖素抗體，37℃孵育60 min，PBS洗2次，再加入1∶150稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗羊二抗，37℃孵育50 min，用PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光的強(qiáng)弱并拍照，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm。

1.4胰高血糖素基因敲降

1.4.1pLVTHM-shglucagon慢病毒載體構(gòu)建 Shglucagon（Gcg glucagon［Rattus norvegicus］Gene ID：24952）質(zhì)粒由華大基因合成。pLVTHM-shglucagon正義鏈：5'-CGCGTACTAGTCCCCGGAAGAAGTCGCCATAGCTGATTCA AGAGATCAGCTATGGCGACTTCTTCCTTTTTGGAAAT-3'，反義鏈：5'-CGATTTCCAAAAAGGAAGAAGTCGCCATAGCT GATCTCTTGAATCAGCTATGGCGACTTCTTCCGGGGACTAG TA-3'，通過Oligo退火合成shDNA，在T4 DNA連接酶作用下，與退火的DNA oligo于4℃連接16 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行陽性鑒定。用磷酸鈣-DNA共沉淀法共轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞HEK-293T，進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝。感染前24 h，調(diào)整293T細(xì)胞密度為2×106/L，接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)即可感染。3種質(zhì)粒［pLVTHM-shglucagon（同時(shí)可表達(dá)綠色熒光蛋白）20μg、pMD2G 5μg和psPAX2 15μg］按比例混合后用無菌去離子水調(diào)到250μL，加入250μL 0.5 mol/L CaCl2混合均勻，然后逐滴緩慢加入500μL 2×HeBS，以最大速度渦旋混勻。實(shí)驗(yàn)臺上靜置30 min，然后稀釋到10 mL新鮮培養(yǎng)基中，加入培養(yǎng)瓶，溫和振動培養(yǎng)瓶使沉淀物均勻分布到細(xì)胞單層上。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入15 mL新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染48 h和72 h后收集細(xì)胞上清培養(yǎng)基，4℃，3 000 r/min離心10 min收集上清并用0.45μm微孔濾膜過濾除菌，慢病毒上清分裝到5 mL無菌EP管中，-80℃保存，可以直接用于轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞。同樣方法制備僅含綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因的陰性對照慢病毒載體。

1.4.2慢病毒感染INS-1細(xì)胞 將上述分裝的慢病毒上清從-80℃冰箱取出，慢病毒上清與目的細(xì)胞培養(yǎng)基的混合比例為1∶2或1∶3，轉(zhuǎn)導(dǎo)INS-1細(xì)胞4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)感染情況將同時(shí)間點(diǎn)的INS-1細(xì)胞分為3組：空白對照組，不進(jìn)行感染，其他培養(yǎng)條件同各感染組；單純轉(zhuǎn)染慢病毒（N-pLV）組，感染pLVTHM，即只含有GFP；敲降胰高血糖素（N-pLV-G）組，感染pLVTHM-shglucagon。48 h在熒光顯微鏡下觀察目的細(xì)胞熒光強(qiáng)弱可以初步判斷慢病毒是否感染成功，繼續(xù)培養(yǎng)至60 d，分別觀察30 d、60 d時(shí)細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱變化。

1.4.3RT-PCR檢測胰高血糖素基因的表達(dá) 將3組細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，應(yīng)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后收集各組細(xì)胞，應(yīng)用Promega試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。胰高血糖素基因的引物序列：上游5'-GTTTACATCGTGGCTGGATTG-3'，下游5'-TGAATTCCTTTGCTGCCTGGC-3'，擴(kuò)增片段 349 bp。參照Promega RT-PCR system試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，50μL反應(yīng)體系添加0.1μg模板，上、下游引物的終濃度分別為1μmol/L。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸3 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描采集圖像。

1.4.4Western blot檢測胰高血糖素蛋白的表達(dá)水平 將3組細(xì)胞以1×105分別接種6孔培養(yǎng)板，3 d后收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量。樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（120 V恒壓）分離，然后按照200 mA恒流電轉(zhuǎn)移70 min，將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)去離子水清洗后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入1∶500稀釋的羊抗鼠胰高血糖素抗體，4℃孵育過夜，TBST漂洗后用1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗羊IgG二抗孵育1.5 h，漂洗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光，X線片顯影。利用美國Bio-Rad公司紫外凝膠成像系統(tǒng)對X線片上的條帶進(jìn)行平均光密度（IOD）值測量。以βactin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5細(xì)胞分泌功能的檢測 將3組細(xì)胞分別種于24孔板，2×106/孔中，每組3個(gè)平行孔。培養(yǎng)72 h后，用含2.5 mmol/L葡萄糖（glucose）的培養(yǎng)基平衡5 h，然后用KRBH（Krebs-Ringer bicarbonate HEPES buffer）液洗2次，分別加入2.5、20 mmol/L glucose的KRBH 0.5 mL，并加入抑肽酶使其終濃度為1 mg/L，刺激細(xì)胞2 h，收集上清液，用于胰島素和胰高血糖素測定。胰島素測定采用ELISA法，胰高血糖素的測定采用放射免疫分析法，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.6MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力 將空白對照組、單純轉(zhuǎn)染慢病毒組和敲降胰高血糖素組細(xì)胞以9×103/孔分別種于96孔板中，用培養(yǎng)液調(diào)整每孔終體積為200μL，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)第0、1、3、5、7天從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板測量細(xì)胞量，首先輕輕吸出每孔培養(yǎng)液，然后每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液30μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸去每孔內(nèi)培養(yǎng)液之后，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩，槍頭吹吸混勻，待細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶紫完全溶解后，在ELX800自動酶標(biāo)儀設(shè)置波長492 nm處讀取每孔光密度（OD）值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.7體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 利用本課題組已成功構(gòu)建的大鼠胰島素瘤動物模型［9］。首先刮取3組細(xì)胞，將其分別移植到裸鼠左腎包膜下，在0、1、2、3、4、5、6周監(jiān)測血糖變化。實(shí)驗(yàn)第45天處死動物，取出雙側(cè)腎臟，肉眼觀察比較不同組動物腎臟大小并拍照。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。即取部分移植部位腎臟經(jīng)10%福爾馬林液固定后，制備石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，微波熱修復(fù)，3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶。一抗分別使用兔抗鼠胰島素抗體、羊抗鼠胰高血糖素抗體，4℃孵育過夜，二抗使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體或兔抗羊IgG抗體，37℃30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明封片后鏡檢，采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析免疫組織化學(xué)染色樣本的IOD值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)；2組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胰島素瘤細(xì)胞的特性分析 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，INS-1細(xì)胞和人胰島素瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)胰島素和胰高血糖素；但作為對照的腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞中兩者都不表達(dá)。見圖1。

2.2胰高血糖素在胰島素瘤形成中的作用

2.2.1INS-1細(xì)胞胰高血糖素基因敲降株的建立 pLVTHM與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的GFP（圖2A），表明慢病毒包裝成功。將包裝好的病毒感染INS-1細(xì)胞后，INS-1細(xì)胞表達(dá)GFP（圖2B），隨著傳代培養(yǎng)時(shí)間的延長，在30 d（圖2C）和60 d（圖2D）時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)GFP的表達(dá)無明顯變化，而與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，敲降后INS-1細(xì)胞中胰高血糖素mRNA（IOD，0.53±0.14vs.1.37±0.42，t=3.184，P＜0.05）和蛋白表達(dá)水平（IOD，0.28±0.06vs.0.96±0.12，t=4.351，P＜0.05）均明顯降低（圖3），說明胰高血糖素基因敲降成功。

Fig.1 The expressions of insulin and glucagon in cells of each group(Immunofluorescence staining,×1 500)圖1 各組細(xì)胞胰島素和胰高血糖素基因的表達(dá)（免疫熒光染色，×1 500）

Fig.2 The glucagon gene knock down in INS-1 cells(×200)圖2 INS-1細(xì)胞中胰高血糖素基因的敲降（×200）

Fig.3 Effects of glucagon gene knockdown on INS-1 cells圖3 INS-1細(xì)胞胰高血糖素基因的敲降效果

2.2.2敲降胰高血糖素對INS-1細(xì)胞分泌功能的影響 敲降INS-1細(xì)胞胰高血糖素基因72 h后，3組低濃度（2.5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡糖糖刺激的胰島素的分泌未見明顯變化（P＞0.05）；敲降胰高血糖素組低濃度、高濃度葡糖糖刺激的胰高血糖素分泌較空白對照組和單純轉(zhuǎn)染慢病毒組明顯降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effects of glucagon knockdown gene on insulin and glucagon secretion in INS-1 cells stimulated by different concentrations of glucose表1 敲降胰高血糖素基因?qū)Σ煌瑵舛绕咸烟谴碳NS-1細(xì)胞胰島素和胰高血糖素分泌功能的影響 （μg/L，n=3，±s）

Tab.1 Effects of glucagon knockdown gene on insulin and glucagon secretion in INS-1 cells stimulated by different concentrations of glucose表1 敲降胰高血糖素基因?qū)Σ煌瑵舛绕咸烟谴碳NS-1細(xì)胞胰島素和胰高血糖素分泌功能的影響 （μg/L，n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組比較，P＜0.05

組別空白對照組N-pLV組N-pLV-G組F胰島素2.5 mmol/L 11.06±1.06 12.29±0.83 11.55±0.88 1.298 20 mmol/L 48.59±2.45 52.09±2.25 55.14±3.87 6.075胰高血糖素2.5 mmol/L 73.45±5.25 78.24±2.50 31.70±1.84ab 158.699＊20 mmol/L 694.79±16.85 692.33±12.30 285.57±15.25ab 749.93＊

2.2.3敲降胰高血糖素對INS-1細(xì)胞增殖能力的影響 MTT結(jié)果顯示，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染空載慢病毒對細(xì)胞增殖能力無明顯影響（P＞0.05），但敲降胰高血糖素基因可以明顯降低INS-1細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05），見圖4。

Fig.4 Effects of glucagon knockdown on proliferation of INS-1 cells圖4 敲降胰高血糖素對INS-1細(xì)胞增殖能力的影響

2.2.4體內(nèi)移植 3組裸鼠血糖在移植第1、2周時(shí)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；移植第3、4、5周時(shí)，3組血糖逐漸下降，但敲降胰高血糖素組血糖仍高于同時(shí)期的空白對照組和單純轉(zhuǎn)染慢病毒組（P＜0.05）；至移植第6周時(shí)3組血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。腎臟大體形態(tài)觀察結(jié)果顯示，敲降胰高血糖素組腎臟腫瘤較單純轉(zhuǎn)染慢病毒組有所減小，見圖6。免疫組化染色結(jié)果顯示，與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，敲降胰高血糖素組細(xì)胞胰島素（IOD）的表達(dá)未見明顯變化（1.67±0.29vs.1.58±0.32，t=0.361，P＞0.05），而胰高血糖素（IOD）表達(dá)降低（0.43±0.08vs.1.51±0.24，t=7.394，P＜0.05），見圖7。

Fig.5 The changes of blood glucose in INS-1 cells after glucagon knockdown and transplanted into the left kidney capsule of nude mice圖5 敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植到裸鼠左腎包膜下后血糖水平的變化

Fig.6 Tumorigenicity after glucagon knockdown in INS-1 cells and transplanted into the left kidney capsule圖6 敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植到裸鼠左腎包膜下后的成瘤情況

3 討論

胰島素瘤起源于胰島β細(xì)胞，約87%屬于良性腫瘤［10］，其中具有胰島素分泌功能的功能性胰島素瘤約占80%［11］，因其過量分泌胰島素可導(dǎo)致反復(fù)低血糖，甚至可引起腦細(xì)胞損傷。由于其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，臨床上極易誤診、誤治［4-5］，且目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞和人胰島素瘤細(xì)胞既表達(dá)胰島素，同時(shí)也表達(dá)胰高血糖素［9］。但關(guān)于胰高血糖素基因是否影響胰島素瘤形成的報(bào)道較少。有研究顯示，正常情況下，胰島α細(xì)胞對胰島β細(xì)胞的存活和胰島素分泌具有支持作用［12］，并且胰高血糖素對胰島β細(xì)胞的增殖和胰島素分泌也有一定的促進(jìn)作用［13］。INS-1細(xì)胞系來自胰島β細(xì)胞經(jīng)過放射線照射誘導(dǎo)成的胰島β細(xì)胞瘤，具有胰島β細(xì)胞的絕大部分功能，可對葡萄糖刺激做出反應(yīng)而分泌大量胰島素。本研究結(jié)果顯示，INS-1細(xì)胞不僅表達(dá)胰島素而且表達(dá)胰高血糖素，與本課題組前期研究結(jié)果一致［9］。

為了進(jìn)一步探討胰高血糖素基因在胰島素瘤形成中的作用，本研究利用慢病毒介導(dǎo)的基因敲降系統(tǒng)建立了胰高血糖素敲降的INS-1細(xì)胞株。由于基因敲降所使用的載體pLVTHM不僅能在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)shRNA，而且表達(dá)GFP，因此本研究利用細(xì)胞表達(dá)GFP的情況初步判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞免疫熒光染色、RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)的基因敲降系統(tǒng)可明顯降低INS-1細(xì)胞中胰高血糖素基因的表達(dá)水平，并且不隨細(xì)胞傳代和增殖而發(fā)生改變，說明本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定敲降的胰高血糖素基因的INS-1細(xì)胞系。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲降胰高血糖素基因可降低INS-1細(xì)胞胰高血糖素的分泌，而對胰島素分泌功能無明顯影響，并且敲降胰高血糖素基因可明顯降低INS-1細(xì)胞的增殖能力，提示體外敲降胰高血糖素基因可抑制胰島素瘤細(xì)胞的增殖。之后，本研究利用本課題組前期已成功構(gòu)建的胰島素瘤動物模型，進(jìn)一步探討胰高血糖素基因敲降在動物整體水平上對胰島素瘤形成的影響［9］，該胰島素瘤模型具有臨床胰島素瘤的特點(diǎn)，適合用于對胰島素瘤的深入研究。

本研究結(jié)果顯示，與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，移植敲降胰高血糖素基因細(xì)胞的裸鼠血糖下降較慢，形成的腫瘤體積也較小。移植瘤免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植組裸鼠移植瘤細(xì)胞胰島素的表達(dá)未見明顯變化，而胰高血糖素表達(dá)明顯降低，提示敲降胰高血糖素基因可在一定程度上抑制胰島素瘤細(xì)胞的增殖，使腫瘤體積較小，并且能減少胰島素的釋放，使裸鼠血糖下降較慢。筆者推測胰島素瘤的生長可能與胰高血糖素基因表達(dá)水平有關(guān)。

Fig.7 Immunohistochemical staining of transplantation site after transplantation of knockdown of glucagon gene cells(×200)圖7 敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植后移植部位的免疫組化染色（×200）