結(jié)腸腺癌中MGMT和galectin-3的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

蘇 賡 梁科慶 羅顯克 溫 偉

結(jié)直腸腺癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，盡管目前診斷和治療方面取得一定的進(jìn)展，但就病死率而言，在引起死亡的癌癥中，它仍位居第4位[1，2]。結(jié)腸腺癌的患者容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，傳統(tǒng)的臨床病理分期不足以確定惡性腫瘤的預(yù)后，需尋找一些可靠的分子生物學(xué)標(biāo)志物。 研究表明很多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與DNA 修復(fù)酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)和半乳糖凝集素-3(galectin-3，GAL-3)表達(dá)異常有關(guān)，本研究通過免疫組化(SP)法對51例結(jié)腸腺癌患者組織，含其中29例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，同期51例炎性結(jié)腸黏膜病變組織中MGMG和galectin-3的表達(dá)進(jìn)行研究，為臨床篩選高危人群，判斷結(jié)腸腺癌、評價預(yù)后及靶向治療提供參考價值[3，4]。

資料與方法

1.一般資料:收集2010年2月～2015年2月廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院51例結(jié)腸腺癌患者組織，含其中29例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，同期51例炎性結(jié)腸黏膜病變組織進(jìn)行研究?；颊甙l(fā)病30～82歲，中位年齡57歲，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放射治療或化學(xué)治療。

2.免疫組化檢測：MGMT和galectin-3單克隆即用型抗體均購自福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，每例標(biāo)本分別進(jìn)行兩種處理:(1)常規(guī)切片HE染色(圖1)復(fù)查診斷。(2)用于免疫組織化學(xué)(免疫組化)染色的標(biāo)本按如下方法處理。10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚3～4μm，貼在預(yù)先涂有多聚賴氨酸的干凈載玻片上，放入55～60℃恒溫箱24h以上，至染色時取出以防止脫片，按常規(guī)SP法染色。設(shè)立對照：以已知MGMT和galectin-3陽性組織切片作為陽性對照，以PBS液代替一抗作為陰性對照。

3.結(jié)果判定：MGMT染色定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)，galectin-3染色定位于細(xì)胞質(zhì)。在光學(xué)顯微鏡下結(jié)合HE片觀察免疫組化染色結(jié)果，結(jié)果判定采用雙盲法，隨機選擇10個高倍視野，每個視野計算100個腫瘤細(xì)胞，無細(xì)胞著色為0分，≥1%且<10%細(xì)胞著色為1分，≥10%且<50%細(xì)胞著色為2分，≥50%以上細(xì)胞著色計3分。染色強度分為：無棕黃色計0分，微弱棕黃色計1分，中等強度棕黃色計2分，褐色或棕褐色計3分。免疫組化結(jié)果以陽性細(xì)胞計數(shù)與著色強度的相乘結(jié)果表示MGMT和galectin-3的表達(dá)強度，0分判定為(-)，1～3分判定為(+)，4～6分判定為(++)，7～10分判定為(+++)。

4.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)用χ2檢驗，相關(guān)分析以Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌、炎性腸黏膜病變中的表達(dá)：51例結(jié)腸腺癌組織中MGMT陽性表達(dá)者30例 (陽性率58.82%，圖1)，在51例炎性腸黏膜病變中陽性表達(dá)40例(陽性率78.43%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；51例結(jié)腸腺癌組織中g(shù)alectin-3 陽性表達(dá)者29例(陽性率56.86%,圖2)，在51例炎性腸黏膜病變中陽性表達(dá)18例(陽性率35.29%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌、炎性腸黏膜病變中的表達(dá)

2.MGMT和galectin-3蛋白與結(jié)腸腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系:MGMT在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對應(yīng)的29例結(jié)腸腺癌根治術(shù)標(biāo)本組織中，陽性率為44.83%(13/29)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對應(yīng)的22例結(jié)腸腺癌根治術(shù)標(biāo)本組織中，陽性率為77.27%(17/22)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。MGMT在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的陽性率(17.24%，5/29)低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組織(44.83%，13/29，圖1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。 galectin-3在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對應(yīng)的29例結(jié)腸腺癌根治術(shù)標(biāo)本組織中，陽性率為68.27%(20/29)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對應(yīng)的22例結(jié)腸腺癌根治術(shù)標(biāo)本組織中，陽性率為40.91%(9/22)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。galectin-3在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的陽性率(93.10%，27/29)高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組織(68.97%，20/29,圖2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表3)。

表2 MGMT和galectin-3在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組織中的陽性率比較

圖1 MGMT在結(jié)腸腺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)(SP,×200)A.結(jié)腸腺癌組織;B.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織

圖2 galectin-3在結(jié)腸腺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)(SP,×200)A.結(jié)腸腺癌組織;B.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織

表3 MGMT和galectin-3在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中陽性率的比較

3.MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌中表達(dá)之間的相關(guān)性分析：應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析MGMT和galectin-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性， 30例MGMT陽性表達(dá)的結(jié)腸腺癌中，galectin-3表達(dá)陰性者17例；21例MGMT陰性表達(dá)的結(jié)腸腺癌中，galectin-3表達(dá)陽性者16例。結(jié)果顯示MGMT蛋白和galectin-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.327，P=0.019)。

討 論

結(jié)腸腺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率與多種因素有關(guān)。烷化劑是一類重要的致癌物質(zhì)，它不僅存在于大量的外界環(huán)境中，它也可以在身體的代謝過程中產(chǎn)生。MGMT是一種高效DNA直接修復(fù)酶,也是目前發(fā)現(xiàn)參與此種修復(fù)的唯一蛋白。該蛋白能夠?qū)⑹軗pDNA O6-mG位的烷化基團轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上,同時自身也因接受了烷化基團而失活，能特異修復(fù)DNA序列中的O6-烷基鳥嘌呤損傷，維持基因組精確性和完整性，防止烷基化合物誘導(dǎo)的致癌作用[5，6]。研究結(jié)果表明, MGMT 的表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤、胃癌、乳腺癌的總體生存率中扮演一個重要的預(yù)警指標(biāo)[7～9]。胃癌組織中MGMT蛋白表達(dá)強度與組織學(xué)分化程度，浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。在浸潤性乳腺癌患者中，所有患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)的MGMT表達(dá)陰性。然而，MGMT表達(dá)與結(jié)腸腺癌的臨床病理特征之間的關(guān)系仍不清楚。目前大部分研究都集中于結(jié)腸腺癌的MGMT 啟動子的甲基化狀態(tài)的激活因素。有研究報道結(jié)直腸癌中 MGMT啟動子區(qū) CpG島存在過度甲基化,導(dǎo)致 MGMT表達(dá)的缺失不能修復(fù)基因損傷，因此引起腫瘤的發(fā)生, 這是目前為止最廣為接受的結(jié)腸腺癌發(fā)生機制之一[10，11]。本組實驗結(jié)果顯示，MGMT在結(jié)腸腺癌中的陽性率低于炎性腸黏膜病變組織。在結(jié)腸腺癌組織中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MGMT陽性率也低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。另外，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中MGMT陽性率也明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，本研究提示MGMT的水平與腫瘤所處的發(fā)展階段有一定關(guān)系,在腫瘤進(jìn)展期MGMT的表達(dá)下調(diào),在侵襲性腫瘤中達(dá)到最低水平。

galectin-3是半乳糖凝集素家族的重要成員，能特異識別并結(jié)合半乳糖苷結(jié)構(gòu)，通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。galectin-3通過與細(xì)胞黏附相關(guān)分子結(jié)合并抑制細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移，從而增加癌細(xì)胞脫離和遷移率[12～14]。臨床研究表明galectin-3高表達(dá)與多種腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移傾向以及患者的預(yù)后有關(guān)，包括甲狀腺乳頭狀癌和宮頸癌在內(nèi)的多種實體瘤組織中高度表達(dá)[15，16]。盡管galectin-3的細(xì)胞外表達(dá)調(diào)節(jié)人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的各個階段，但其在結(jié)腸腺癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，遷移和轉(zhuǎn)移潛能中的作用的機制細(xì)節(jié)尚不清楚。Korkmaz等[17]報道，結(jié)腸直腸腺癌組織中g(shù)alectin-3的表達(dá)顯著高于正常腸組織。這些報告得出結(jié)論，半乳糖凝集素-3在結(jié)腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，本組研究結(jié)果顯示，galectin-3在結(jié)腸腺癌中的陽性率高于炎性腸黏膜病變組織。在51例結(jié)腸腺癌組織中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中g(shù)alectin-3陽性表達(dá)亦高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。另外，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中g(shù)alectin-3的陽性率也明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。上述結(jié)果說明，galectin-3與結(jié)腸腺癌淋巴結(jié)的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，且galectin-3陽性的結(jié)腸腺癌患者較galectin-3陰性患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率更高，這一結(jié)果與Mahmoud等[18]的研究結(jié)果類似。因此，galectin-3對促進(jìn)結(jié)腸腺癌的浸潤具有重要作用，有可能成為判斷結(jié)腸腺癌發(fā)病與轉(zhuǎn)移的觀測指標(biāo)，對于腫瘤性質(zhì)及預(yù)后的判斷具有重要參考價值。

MGMT在結(jié)腸腺癌組織中低表達(dá)，而galectin-3高表達(dá)，兩者表達(dá)進(jìn)行Spearman等級相關(guān)分析表明，MGMT和galectin-3兩種之間呈負(fù)相關(guān)。因此，筆者推測MGMT的減少或缺失可能增加了galectin-3表達(dá)，galectin-3通過與細(xì)胞黏附相關(guān)分子結(jié)合并抑制細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)了癌變的可能，兩者在結(jié)腸腺癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲中具有重要作用。

總之，結(jié)腸腺癌的轉(zhuǎn)移是患者最大的威脅，也是在治療中遇到的最大障礙。MGMT、galectin-3與結(jié)腸腺癌的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)， MGMT表達(dá)的降低和galectin-3的高表達(dá)促進(jìn)了結(jié)腸腺癌發(fā)生、發(fā)展，是腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化和惡變的分子異常事件。因此，MGMT和galectin-3可作為評價結(jié)腸腺癌細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移能力的生物學(xué)指標(biāo)。