黃芪甲苷提取分離實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于高職生物學(xué)教學(xué)的探討*

顏珊珊 羅 艷 盧豆豆 梁俊玉

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070）

黃芪（Astragalus）藥用歷史悠久，古有“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”之稱，為歷代中醫(yī)最常用的中藥之一。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)黃芪的化學(xué)組成、藥理活性進(jìn)行了較為廣泛的研究。成分分析表明，黃芪內(nèi)含有甲苷、多糖、三萜、黃酮等成分。藥理實(shí)驗(yàn)及臨床報(bào)道表明，黃芪在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、糖尿病、延緩衰老等方面具有重要作用［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，以黃芪為原料的中成藥達(dá)200 多種，是我國(guó)出口的商品之一［2］。因此，對(duì)黃芪的各成分進(jìn)行分析具有指導(dǎo)性意義。

黃芪甲苷Astragaloside IV 作為中藥黃芪的主要有效成分，可改善心肺功能、降低血壓、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、抑制病毒繁殖和腫瘤生長(zhǎng)［3］。本次教學(xué)主要以膜莢黃芪或蒙古黃芪為原材料，將黃芪甲苷提取分離技術(shù)作為職業(yè)院校生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容進(jìn)行嘗試，證實(shí)黃芪甲苷的提取分離在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的各環(huán)節(jié)均具有可控性，學(xué)生可順利完成實(shí)驗(yàn)并得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利于實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)目標(biāo)的有效達(dá)成。

1 黃芪甲苷的研究?jī)r(jià)值

黃芪為膜莢黃芪或者蒙古黃芪的干燥根，又名綿芪，隸屬于豆科黃芪屬，該屬絕大多數(shù)植物具有藥用價(jià)值［4-5］。

黃芪甲苷是一種從黃芪中提取的高純度藥物。黃芪的主要有效成分包括黃芪多糖、黃酮、萜類等物質(zhì)［4］，其中黃芪多糖的主要有效成分是多糖和黃芪苷。黃芪苷又分為黃芪苷Ⅰ、黃芪苷Ⅱ、黃芪苷Ⅳ，生物活性最好的是黃芪苷Ⅳ，即黃芪甲苷。黃芪甲苷不僅具有黃芪多糖的作用，還具有一些黃芪多糖無法比擬的作用，其藥效強(qiáng)度是常規(guī)黃芪多糖的2 倍多，抗病毒作用更是黃芪多糖的30 倍［6-9］。由于含量少、效果好，黃芪甲苷更是有“超級(jí)黃芪多糖”之稱［10］。本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)以純度為98%的黃芪甲苷為對(duì)照品，采用水飽和正丁醇與氨水提取分離黃芪甲苷，HPLC-ELSD 法檢測(cè)黃芪中甲苷的分離效果。

2 黃芪甲苷提取分離實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

2.1 教學(xué)目標(biāo)

1）知識(shí)目標(biāo)：①通過查閱相關(guān)資料，對(duì)中草藥黃芪和黃芪甲苷的藥用價(jià)值產(chǎn)生濃厚的學(xué)習(xí)興趣；②掌握黃芪甲苷提取分離的原理，明確實(shí)驗(yàn)中的操作步驟、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)；③能解釋黃芪甲苷提取分離過程中各種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

2）能力目標(biāo)：①學(xué)會(huì)并注重高效液相色譜儀（HPLC-ELSD）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等實(shí)驗(yàn)設(shè)備的使用及注意事項(xiàng)；②掌握分液漏斗分離的原理，并能對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行萃取分離。

3）情感態(tài)度與價(jià)值觀目標(biāo)：對(duì)中草藥黃芪及黃芪中各有效成分的藥用價(jià)值產(chǎn)生濃厚興趣。

2.2 教學(xué)活動(dòng)組織 實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)開始前，教師整理并分發(fā)實(shí)驗(yàn)資料。為了達(dá)到更好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，教師應(yīng)依據(jù)學(xué)生不同年齡階段特征或者成績(jī)，合理分組，每組6 人左右。同時(shí)，各組選出組長(zhǎng)，負(fù)責(zé)每組的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度安排與督查，并將最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果向教師匯報(bào)。

在實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)中，每組成員必須全部參與活動(dòng)，親自操作，互學(xué)互助。教師觀察并對(duì)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作過程進(jìn)行點(diǎn)評(píng)與指導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)結(jié)束后，各組匯報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行小組間討論與反思。教師提出意見與點(diǎn)評(píng)。

2.3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)程及安排

2.3.1 材料與儀器

試劑：黃芪甲苷對(duì)照品（純度為98%）、色譜純乙腈和甲醇、分析純甲醇、超純水、水飽和正丁醇（正丁醇∶水=700∶300，靜止過夜后取上層溶液使用）、20%氨水。

儀器：高效液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴鍋、分液漏斗、粉碎機(jī)。

材料準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)選用的黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.的干燥根。取適量黃芪，放入50℃的恒溫烘箱中，除去水分（直至烘干前后質(zhì)量相差不到0.1 g）。用粉碎機(jī)將黃芪粉碎，備用。

2.3.2 高效液相色譜操作說明

1）上樣前：①制備流動(dòng)相：在A、B、C 3 個(gè)瓶中分別裝入色譜甲醇、色譜乙腈、超純水。所有流動(dòng)相必須先經(jīng)過抽濾，再超聲40 min，目的是除去雜質(zhì)和氣泡；②制備清洗液：在專門清洗的瓶中裝入色譜甲醇-超純水（10∶1）；③裝柱：按照箭頭指示方向裝好柱子；④設(shè)置條件：乙腈-水（35∶65）為流動(dòng)相，流速為1 min／mL，柱溫為30℃，氣化與霧化溫度為50℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2）上樣中：調(diào)整基線（即從0 開始），注射樣品（樣品不能含有氣泡），并對(duì)樣品命名。

3）上樣后：樣品結(jié)束后，將流動(dòng)相改為甲醇－水（50∶50）沖洗柱子，直至在純甲醇沖洗，流速為0.6 min／mL 時(shí)，泵壓＜50 Mpa，代表柱子沖洗干凈，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)操作步驟與流程［11］

1）色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（35∶65）為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。

2）對(duì)照品溶液的制備：取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每l mL 含0.5 mg 黃芪甲苷的對(duì)照溶液，即得。

3）實(shí)驗(yàn)樣品溶液的制備：取本品中粉末約4 g，精密稱定，置索氏提取器中。加入40 mL 甲醇，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解。用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干。殘?jiān)铀? mL 使溶解，放冷。通過D101 型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50 mL 洗脫，棄水液，再用40%乙醇30 mL 洗脫，棄洗脫液，繼用70%乙醇80 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

4）測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液，實(shí)驗(yàn)樣品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在教師組織下，學(xué)生進(jìn)行黃芪甲苷專題討論，并書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。討論主要集中在2 個(gè)方面，一是評(píng)價(jià)用HPLC-ELSD 法檢測(cè)出的黃芪甲苷提取分離效果；二是匯總實(shí)驗(yàn)過程中的主要易錯(cuò)操作環(huán)節(jié)及注意事項(xiàng)。最終由教師點(diǎn)評(píng)各小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果及表現(xiàn)。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 黃芪甲苷在提取分離過程中對(duì)溫度、濕度的要求并不苛刻，一般實(shí)驗(yàn)室都能達(dá)到。只要在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，學(xué)生能嚴(yán)格按照教師的要求規(guī)范操作，注意實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及注意事項(xiàng)，一般都能得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪甲苷出峰時(shí)間在40 min左右。

本次實(shí)驗(yàn)中，全班共36 人，分成6 人一組。其中有4 個(gè)小組都得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2），黃芪甲苷在40 min 左右的時(shí)間點(diǎn)出峰，單峰且色譜峰型尖銳對(duì)稱，明顯與其他雜質(zhì)分離。剩余2 組的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題（圖3），出現(xiàn)平峰，原因是最終定容的體積不同，濃度過大。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)分析

1）黃芪甲苷對(duì)照品溶液必須在48 h 內(nèi)使用。

2）索氏提取過程中，第2 次加入的分析純甲醇量要盡量多些，以防在80℃的水浴鍋蒸發(fā)下，溶劑難以回流?；亓魉俣瓤刂圃?～2 s／滴。學(xué)生在操作過程中，要盡量控制平行樣的流速保持一致，減少誤差。

3）使用分液漏斗時(shí)，溶液要充分搖勻。如果力度過小，溶液不能分布均勻，分層不明顯；如果力度過大，溶液容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，靜止時(shí)間需延長(zhǎng)，以便分層明顯。

4）使用D101 型大孔樹脂前，要先用無水乙醇浸泡一夜。第2 天，裝柱過程中，先用去離子水將D101 型大孔樹脂沖至無乙醇味，柱高55 cm 左右。

5）用濾紙包裹黃芪樣品置于索氏提取器中，要包裹適當(dāng)。不要裹得過于嚴(yán)實(shí)，以防甲醇回流中，不能將樣品中間的部分沖洗干凈。同時(shí)，也不能包裹得過于松散，避免樣品漏出濾紙，堵塞回流。

6）在2 次使用分液漏斗時(shí)，要注意區(qū)別分離后的上下層溶液。第1 次，將樣品與40 mL 水飽和正丁醇置于分液漏斗中，上下?lián)u勻后，上層為正丁醇，下層為多糖與蛋白質(zhì)。第2 次，將合并的正丁醇和氨試液置于分液漏斗中搖勻，上層為正丁醇與甲苷，下層為氨試液。

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)總結(jié)與反思

目前高職院校主要以學(xué)生專業(yè)技能的掌握為導(dǎo)向，注重學(xué)生的實(shí)踐操作能力培養(yǎng)。高職院校教師應(yīng)根據(jù)學(xué)生所處的不同年齡階段，選擇合理的教學(xué)方式，因材施教。

3.1 合理組織實(shí)驗(yàn)教學(xué)，注重以學(xué)生為中心的教學(xué)方式 為更好地組織與安排生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)開展前，教師應(yīng)依據(jù)學(xué)生各方面特點(diǎn)進(jìn)行有效分組，提前講述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，合理安排實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作。同時(shí)，每組選出組長(zhǎng)，對(duì)整個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)分工進(jìn)行安排。實(shí)驗(yàn)過程中，教師要密切關(guān)注學(xué)生操作過程中的表現(xiàn)，對(duì)學(xué)生實(shí)驗(yàn)中的不當(dāng)操作進(jìn)行糾正，對(duì)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中遇見的問題進(jìn)行點(diǎn)撥與引導(dǎo)。各小組可針對(duì)本組中存在的問題進(jìn)行討論與建議。最后，教師依據(jù)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果及表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，提出意見與建議。

3.2 重視因材施教，培養(yǎng)小組合作意識(shí) 本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)內(nèi)容多且繁瑣，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。為更好地達(dá)到實(shí)驗(yàn)課堂的教學(xué)目標(biāo)，教師應(yīng)當(dāng)因材施教，促成小組合作，互相幫助。高職學(xué)生對(duì)于提取分離較為陌生，采用實(shí)驗(yàn)方式更加通俗，易于理解與掌握。同時(shí)實(shí)驗(yàn)離不開各小組成員的協(xié)作，例如高效液相流動(dòng)相的制備與黃芪樣品的處理，需要小組成員全部參與到實(shí)驗(yàn)中，共同完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，體驗(yàn)參與實(shí)驗(yàn)的樂趣。

3.3 激發(fā)學(xué)生思維碰撞，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)、解決問題能力 在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，學(xué)生進(jìn)行自主交流，思維碰撞，教師輔助、引導(dǎo)學(xué)生反復(fù)深入思考，例如“高效液相實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得平峰的原因是什么？”不拘泥于教材內(nèi)容，激發(fā)學(xué)生的多向思維，培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力。