水杉組織培養(yǎng)研究

于飛飛

（山東省北鎮(zhèn)中學(xué) 山東濱州 256600）

水杉（Metasequoia glyptostroboidesHu et Cheng)隸屬杉科（Taxodiaceae）水杉屬（Metasequoia），是世界上珍稀的孑遺植物，我國(guó)一級(jí)保護(hù)的特有樹(shù)種［1］。人們普遍認(rèn)為它在第四紀(jì)冰川期滅絕，1941年日本研究者M(jìn)iKi 通過(guò)對(duì)水杉化石的研究建立了屬名［2］。我國(guó)植物學(xué)家在湖北省利川市謀道溪鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)了水杉活株，經(jīng)多方鑒定，1948年胡先嘯和鄭萬(wàn)鈞將其正式命名為水杉，并公布于世［3］。

目前對(duì)于水杉繁育技術(shù)的研究重點(diǎn)主要集中在種子繁殖和扦插育苗方面［4-7］。20世紀(jì)80年代中期，水杉多代扦插苗木生長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱并且大量出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)許多地區(qū)水杉苗木重復(fù)多代扦插后，普遍出現(xiàn)生根推遲、生根率下降、生長(zhǎng)勢(shì)衰退的情況［8］，影響了水杉種苗的推廣與馴化繁殖。因此其組織培養(yǎng)技術(shù)的建立可以在短時(shí)間內(nèi)提供大量苗木，并為以后的遺傳改良、良種繁育、遺傳轉(zhuǎn)化研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)材料 在重慶南川金佛山自然保護(hù)區(qū)原生常綠闊葉林中，采集水杉的帶腋芽莖段及頂芽為材料，培養(yǎng)再生植株。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 選取水杉生長(zhǎng)旺盛的帶腋芽莖段或莖尖，用流水沖洗30 min，無(wú)菌條件下用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水洗凈，再用吐溫-80（2～3 滴／100 mL）和0.2% HgCl2浸洗消毒，無(wú)菌水洗凈后濾紙吸干，留取約1 cm 的長(zhǎng)段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種3～5 個(gè)外植體，以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，外加不同濃度的2，4-D、NAA、6-BA 進(jìn)行離體培養(yǎng)，pH＝5.8，滅菌。按正交表L9（33）設(shè)計(jì)培養(yǎng)基表，每種激素組合接種5～6 瓶（表1），然后置于光照16 h／d，光照強(qiáng)度1 500 lx，（25±2）℃條件下培養(yǎng)。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)影響因素水平表（單位：mg／L）

1.2.2 繼代及分化培養(yǎng)基 將初代培養(yǎng)得到的叢生芽分割，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)（表2）。材料接種2 周后定期觀測(cè)，活性炭實(shí)驗(yàn)采用編號(hào)為5 的培養(yǎng)基，分別添加0.5 g／L、0.7 g／L、0.9 g／L、1.2 g／L 的活性炭對(duì)水杉的愈傷組 織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

表2 愈傷組織繼代及分化培養(yǎng)基（單位：mg／L）

1.2.3 生根培養(yǎng)基 剪取健壯、葉色正常、無(wú)玻璃化的1.5～2.0 cm 長(zhǎng)的水杉組培幼芽用于生根。以1／2 MS 為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的IBA、NAA 及一定濃度的活性炭，并定期觀察它們的生長(zhǎng)狀況。培養(yǎng)基組合如表3所示。

表3 小苗生根培養(yǎng)基（單位：mg／L）

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì) 所有外植體從開(kāi)始形成愈傷組織后，每3 d 觀察一次。以第24 天觀察統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。初愈時(shí)間為在外植體上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)愈傷組織的時(shí)間，愈傷組織誘導(dǎo)率=（出愈外植體數(shù)／接種無(wú)感染外植體數(shù)）×100%。

2.2 繼代培養(yǎng)過(guò)程中分化情況及褐化率統(tǒng)計(jì) 繼代培養(yǎng)后，每5 d 觀察一次，記錄愈傷組織生長(zhǎng)情況，后進(jìn)行分化情況統(tǒng)計(jì)，20 d 后進(jìn)行褐化情況統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。在不同的激素種類(lèi)及濃度的處理中，水杉外植體大部分都能產(chǎn)生愈傷組織。采用培養(yǎng)基MS+2，4-D（2.0 mg／L）+NAA（3.0 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），水杉愈傷組織誘導(dǎo)率為91.4%，初愈時(shí)間為20 d 左右（圖1）。

表5 外植體愈傷組織誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

3.2 愈傷組織的繼代與分化 從表6可以看出，不同激素及其配比對(duì)水杉愈傷組織的繼代及分化存在明顯差異，分化培養(yǎng)基最佳為MS+NAA（0.2 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），出芽率為30.2%（圖2顯示愈傷組織形成芽點(diǎn)）。由表7方差分析可見(jiàn)，其中6-BA 濃度對(duì)萌芽率的影響及為顯著，而NAA 濃度對(duì)萌芽率的影響不顯著。

表6 愈傷組織繼代及分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表7 愈傷組織繼代及分化實(shí)驗(yàn)方差分析表

3.3 5 號(hào)培養(yǎng)基褐化結(jié)果分析 水杉外植體的褐變現(xiàn)象比較嚴(yán)重，0.9 g／L 的活性炭對(duì)于防止外植體褐變效果最好，可以把褐變率降低到25.9%并保持較高的出芽率（21.5%）。但是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示活性炭能夠阻礙組培苗莖的伸長(zhǎng)，而促進(jìn)葉的迅速生長(zhǎng)。

3.4 水杉組培苗生根結(jié)果分析 由表8可以看出，水杉不定根的誘導(dǎo)比較困難，在1／2MS+NAA（3.0 mg／L）+IBA（0.1 mg／L）培養(yǎng)基上生根率最高僅為18.8%（圖3）。將已經(jīng)生根的小苗轉(zhuǎn)移到不含激素的MS 培養(yǎng)基上，根系會(huì)繼續(xù)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)并且發(fā)生不定根（圖4），培養(yǎng)15 d 后平均根數(shù)可達(dá)到45條，平均根長(zhǎng)達(dá)2.56 cm，最長(zhǎng)根長(zhǎng)4.51 cm。

表8 水杉組培苗生根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9 水杉組培苗生根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方差分析表

4 結(jié)論

4.1 水杉愈傷組織誘導(dǎo)率高 本實(shí)驗(yàn)中，水杉外植體萌動(dòng)率較高，研究發(fā)現(xiàn)，采用培養(yǎng)基MS+2，4-D（2.0 mg／L）+NAA（3.0 mg／L）+6-BA（l.5 mg／L），水杉愈傷組織誘導(dǎo)率為91.4%，初愈時(shí)間為20 d左右。水杉在繼代培養(yǎng)中觀察到3 種類(lèi)型的愈傷組織：①質(zhì)地疏松或致密的黃色愈傷組織，多次繼代培養(yǎng)生長(zhǎng)快；②質(zhì)地致密黃綠色或白色的愈傷組織，多次繼代培養(yǎng)仍能增殖；③質(zhì)地疏松黃褐色的愈傷組織，生長(zhǎng)緩慢，在繼代培養(yǎng)中絕大多數(shù)變褐死亡，只有其中少數(shù)愈傷組織能產(chǎn)生新的白色愈傷組織。

4.2 水杉組培成苗率低 水杉離體組織培養(yǎng)獲得再生植株從理論上應(yīng)該可以成功，卻只有少部分成苗，未能獲得突破性進(jìn)展。探究原因，可能主要在以下2 個(gè)方面：一是該屬植物遺傳特性所致，水杉為木本裸子植物，木本植物再生率低一直是困擾其再生的主要原因；二是所提供的培養(yǎng)條件可能不適于水杉外植體的生長(zhǎng)，通常外植體的萌發(fā)成苗與光照、溫度、水分和通氣條件等因素密切相關(guān)，同時(shí)其代謝產(chǎn)物也會(huì)或多或少影響植株的生長(zhǎng)。最佳分化培養(yǎng)基組合為MS+NAA（0.2 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），出芽率為30.2%，叢芽產(chǎn)生率較低。最佳生根培養(yǎng)基組 合為1／2MS+NAA（3.0 mg／L）+IBA（0.1 mg／L），生根率最高僅為18.8%。