XPNPEP2 在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

王偉 周穎 蔣桂英 魏睿 陳曦 奚玲 李飛

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤生物醫(yī)學(xué)中心（武漢430030）

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。盡管近年來在手術(shù)和其他治療方面取得了顯著的成就，但胃癌患者的5年生存率仍然很低［1］。因此，進(jìn)一步研究胃癌的分子機(jī)制從而為胃癌提供更加合理的治療方案十分緊迫。XPNPEP2（aminopeptidase P2，氨基肽酶P2 或APP2）是由位于Xq 25 染色體上的人XPNPEP2 基因編碼［3］的一種膜結(jié)合金屬蛋白酶，可催化去除氨基酸序列中脯氨酸N 端P1 位點(diǎn)的氨基酸殘基［2］。膠原蛋白、激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等生物活性肽的N 末端都含有xaa-Pro 序 列，因 此 是XPNPEP2 的 潛 在 底 物［3］。XPNPEP2 參與調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張劑緩激肽的代謝，目前其研究主要集中在心血管疾病方面，研究發(fā)現(xiàn)XPNPEP2 可能影響ACEI 藥物引起的血管性水腫副作用的發(fā)生率［4］。且XPNPEP2 基因是女性卵巢早衰的標(biāo)記基因之一［5］，近年來亦有報(bào)道XPNPEP2 可影響卵泡的發(fā)育成熟［6］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)XPNPEP2 為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志，在宮頸癌中高表達(dá)并可促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移［7］。筆者在Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫(kù)中亦發(fā)現(xiàn)胃癌患者中XPNPEP2 mRNA 高表達(dá)可能預(yù)示著較低存活率。因此思考XPNPEP2 的改變是否可提示胃癌的發(fā)生與發(fā)展，然而，尚未有學(xué)者就XPNPEP2 在胃癌中的表達(dá)及作用進(jìn)行報(bào)道。故本研究基于組織芯片技術(shù)，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)XPNPEP2 蛋白在72 例胃癌組織及與之部分配對(duì)的60 例癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，希望能為胃癌的診斷及預(yù)后提供新的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料附有相關(guān)臨床病理信息及術(shù)后隨訪資料的孔徑1.5 mm的胃癌組織芯片1張。組織芯片標(biāo)本來源于華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院2006年7月至2007年4月期間行胃癌根治術(shù)的患者72 例。標(biāo)本均經(jīng)病理確診為胃癌，其臨床分期根據(jù)美國(guó)癌癥分期委員會(huì)制定的胃癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，取60 例癌旁組織。72 例胃癌患者中有40 例患者脈管浸潤(rùn)病理診斷不明確，故未納入統(tǒng)計(jì)。標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋。本次標(biāo)本使用經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本組病例性別、年齡、腫瘤大小、脈管浸潤(rùn)、臨床分期等見表1。

表1 XPNPEP2 在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between expression of XPNPEP2 and clinicopathological parameters in gastric carcinoma

1.2 主要試劑兔抗人XPNPEP2 多克隆抗體（GTX109995，1∶200），SP 染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒、蘇木素染色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化將組織芯片蠟塊以4 μm 連續(xù)切片，篩選完整樣本切片先做HE 染色，再嚴(yán)格按照免疫組化SP 法試劑盒說明進(jìn)行操作。切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟；再置于二甲苯中脫蠟2 次；酒精梯度脫水；抗原修復(fù)；阻斷過氧化物酶；山羊血清室溫封閉；封一抗、封HRP 標(biāo)記二抗，DAB 顯色；蘇木精復(fù)染；自來水分化；中性樹脂封片，顯微鏡觀察。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷采用雙盲法由2 名病理科醫(yī)生對(duì)免疫組化結(jié)果閱片并評(píng)分。XPNPEP2 陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色至深褐色。參照文獻(xiàn)［8］按陽(yáng)性著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性著色強(qiáng)度：0分（陰性），1分（弱陽(yáng)性，淺黃色），2分（中等陽(yáng)性，棕黃色），3 分（強(qiáng)陽(yáng)性，褐色）。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0 分（0%），1 分（1%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4分（76%～100%）。免疫染色總分=陽(yáng)性著色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分?？偡址秶? ～12分，0 ～4分為低表達(dá)，5 ～12分為高表達(dá)。

1.5 隨訪采取電話隨訪、患者所在地公安局人口處查詢等方式隨訪，隨訪截止時(shí)間2014年9月，隨訪時(shí)間1 ～90 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間48 個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，預(yù)后評(píng)估運(yùn)用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型。以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XPNPEP2 在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)如圖1 所示，XPNPEP2 蛋白陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。XPNPEP2 蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的高表達(dá)率分別為61.11%、43.33%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.153，P=0.042）。

2.2 XPNPEP2 蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系XPNPEP2 在胃癌組織中的表達(dá)情況與臨床各病理參數(shù)如年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)程度、脈管浸潤(rùn)和TNM 分期均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P ＞0.05），見表1。

2.3 XPNPEP2 蛋白表達(dá)情況與胃癌患者總生存期及預(yù)后的關(guān)系72 例胃癌患者中，XPNPEP2 高表達(dá)患者44 例，生存率為20.5%；XPNPEP2 低表達(dá)患者28 例，生存率為42.9%。高表達(dá)組患者平均生存時(shí)間為35.3 個(gè)月，95%CI：25.77 ～44.91；低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間為55.0 個(gè)月，95%CI：42.48 ～67.52（圖2），XPNPEP2 蛋白高表達(dá)患者與低表達(dá)患者總生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 5.44，P = 0.02）。且在Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中876 例胃癌患者的資料亦發(fā)現(xiàn)XPNPEP2 高表達(dá)者的總生存期明顯短于低表達(dá)者（P ＜0.01），見圖3。

圖1 XPNPEP 在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×200，×400）Fig.1 Expression of XPNPEP in gastric carcinoma and adjacent normal tissues

圖2 XPNPEP2 高低表達(dá)組總生存期比較Fig.2 Comparison of over all survival between high and low XPNPEP2 expression levels

圖3 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中XPNPEP2 mRNA 表達(dá)水平對(duì)胃癌預(yù)后的影響Fig.3 The prognostic of the XPNPEP2 mRNA level in gastric cancer was got from Kaplan-Meier Plotter

單因素COX 分析顯示：胃癌患者的預(yù)后與XPNPEP2 表達(dá)水平（χ2= 5.09，P = 0.024）、脈管浸潤(rùn)（χ2= 19.25，P ＜0.001）、TMN 分期（χ2= 7.39，P = 0.007）緊密相關(guān)，XPNPEP2 高表達(dá)、脈管發(fā)生浸潤(rùn)、TMN 分期Ⅲ+Ⅳ期患者預(yù)后明顯更差（表2）；將單因素分析中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Cox 分析示，脈管浸潤(rùn)是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素（χ2=16.69，P ＜0.001）（表3）。

表2 單因素COX 生存分析Tab.2 Univariate cox survival analysis

表3 多因素COX 生存分析Tab.3 Multivariate cox survival analysis

3 討論

中國(guó)胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%，在全球183 個(gè)國(guó)家中發(fā)病率位于第5 位，病死率位于第6 位［9］。然而胃癌的發(fā)病原因尚未完全明了。

前期研究發(fā)現(xiàn)氨基肽酶M 與皮膚癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］，XPNPEP2 可通過snail 介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生從而促進(jìn)宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移［7］，但目前尚未見XPNPEP2 在其他腫瘤中的報(bào)道。在本研究中，筆者用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)和比較72 例胃癌組織及其部分配對(duì)的60 例癌旁組織中XPNPEP2 的表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)分析顯示胃癌患者XPNPEP2 蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，提示XPNPEP2 在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究［11］表明，EMT 與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)XPNPEP2 在宮頸癌中促進(jìn)EMT 誘導(dǎo)宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移［7］，胃癌組織中高表達(dá)的XPNPEP2 可能亦可通過snail 介導(dǎo)EMT，進(jìn)而促進(jìn)胃癌侵襲。細(xì)胞增殖凋亡與胃癌發(fā)生發(fā)展密不可分，腫瘤增殖因子Ki67 在胃癌發(fā)展過程中扮演重要角色［12］。在組織芯片閱片過程中，筆者發(fā)現(xiàn)XPNPEP2 在癌旁組織近基底層細(xì)胞染色較腺上皮明顯更深，提示XPNPEP2 可能可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。但是，在胃癌組織中XPNPEP2 的表達(dá)水平與臨床各病理參數(shù)并未見明顯相關(guān)性，這可能由于本次研究樣本較少，尚不能檢測(cè)出其差異。KM 生存曲線分析胃癌患者中XPNPEP2 蛋白高表達(dá)可能預(yù)示著較低的存活率，此外，本次研究采用Kaplan-Meier Plotte 在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析XPNPEP2 在876 例胃癌患者中的表達(dá)與OS（總生存率）的相關(guān)性，數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果與本次研究相符。進(jìn)一步證明XPNPEP2 在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而，為進(jìn)一步驗(yàn)證XPNPEP2在胃癌中的潛在預(yù)后價(jià)值，在COX比例風(fēng)險(xiǎn)模中進(jìn)一步驗(yàn)證時(shí)卻發(fā)現(xiàn)XPNPEP2 并不是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本次研究結(jié)果表明胃癌組織中XPNPEP2 蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織，但不足以顯示XPNPEP2蛋白的表達(dá)水平對(duì)胃癌患者生存期有影響，后期需通過擴(kuò)大樣本量等方法進(jìn)一步研究。