超臨界二氧化碳萃取核桃青皮多酚及其體內(nèi)抗氧化性

劉迪，宋曉宇，李婧，尚華，楊建民

1. 陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院（咸陽 712000）；2. 陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司（西安 710100）

核桃青皮（Walnut green husk）又稱青龍衣，功效成分多樣，含有萘醌、多酚、多糖等多種有效成分[1-4]，因其具有鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎、抗腫瘤等多種功效[5-9]，在中國古代就被入藥使用。

但是，目前大量的核桃青皮資源沒有被綜合利用，而是作為廢料被丟棄。因此，試驗(yàn)以核桃青皮為分離原料，采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)分離核桃青皮多酚，并利用正交試驗(yàn)優(yōu)化分離條件，同時(shí)考察提取物體內(nèi)抗氧化活性，為核桃青皮多酚工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮粉，購于陜西省寶雞市，在50 ℃條件下烘干，粉碎后過0.15 mm孔徑篩，封裝后在0～4 ℃冰箱保存；沒食子酸、福林酚試劑、無水Na2CO3、95%乙醇、抗壞血酸（VC），均為分析純；丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5300 PC型紫外/可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；AL 204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；HA 120-40-01超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性昆明種小鼠（體質(zhì)量20±2 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[10]

配置50 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL，分別放入25 mL具塞比色管中，依次加入8.75 mL 20%福林酚試劑、5.00 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水定容。放置40 min后以樣品空白為參比溶液，在760 nm波長處測其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 超臨界CO2萃取單因素試驗(yàn)

選取萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、夾帶劑用量、CO2流量6個(gè)單因素作為考察因素。稱取50 g的核桃青皮粉，按一定比例與一定體積分?jǐn)?shù)乙醇攪拌混勻，放入到超臨界萃取釜中，在一定條件下進(jìn)行萃取。萃取過程中，設(shè)定分離壓力10 MPa、分離溫度25 ℃。按照1.3.1的方法，測定提取物多酚含量，平行試驗(yàn)3次，計(jì)算每次試驗(yàn)提取量（mg多酚/g核桃青皮粉）、提取量平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

R=C×V×1 000/（m×1 000） （1）式中：R為核桃青皮提取量，mg/g；C為提取液中核桃青皮多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為核桃青皮粉質(zhì)量，g。

1.4.3 超臨界CO2萃取正交試驗(yàn)[11-15]

選用六因素三水平，應(yīng)用L18(37)正交表，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，按照1.3.2的方法進(jìn)行超臨界CO2萃取，優(yōu)化萃取條件。

1.4.4 動(dòng)物試驗(yàn)方法

小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組、提取物組和VC組，每組30只，分籠飼養(yǎng)。小鼠先在SPF動(dòng)物房適應(yīng)3 d。用純水將提取物和VC溶解成0.4 g/mL的水溶液。每組每天用灌胃針灌胃1次，按0.1 mL/10 g體重連續(xù)灌胃15 d。

1.4.5 體內(nèi)抗氧化活性[16-21]

末次灌胃1 h后，分別從每組取10只小鼠，將小鼠置于水深30 cm、水溫25.0±1.0 ℃的水箱中游泳90 min，小鼠用乙醚麻醉后從動(dòng)脈取血，將血液在4 000 r/min下離心10 min后取血清，用分光光度法按照丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測試盒說明檢測MDA含量、SOD活力和GSH-PX活力。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)和體外抗氧化性試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示；正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用正交設(shè)計(jì)助手3.1軟件處理和分析；數(shù)據(jù)顯著性分析用t-檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，p＜0.05表示顯著性差異，p＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.095 6x+0.026 2，回歸系數(shù)R2=0.995 9，可以用于多酚檢測。

2.2 超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2為萃取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果。萃取溫度30～50℃時(shí)，提取量隨著萃取溫度增大而逐漸升高，50 ℃達(dá)到最大，高于50 ℃后提取量反而下降。圖3為萃取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果，萃取壓力增大，提取量也隨之增大，但30 MPa以后增幅明顯減少，趨于平緩。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 萃取溫度單因素試驗(yàn)

圖3 萃取壓力單因素試驗(yàn)

圖4 為萃取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果，萃取時(shí)間增大，提取量也變大，但萃取時(shí)間6 h之后提取量增幅趨于平緩。圖5為乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而逐漸升高，70%達(dá)到最大，大于70%后提取量反而下降。

圖4 萃取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖6 為夾帶劑用量單因素試驗(yàn)結(jié)果，在2～3 mL/g的夾帶劑用量范圍內(nèi)，用量升高提取量也變大，大于3 mL/g之后提取量反而下降，并趨于平緩。圖7為CO2流量單因素試驗(yàn)結(jié)果，在20～25 kg/h的CO2流量范圍內(nèi)，流量升高，提取量也變大，但大于25 kg/h之后提取量反而下降，在35 kg/h后趨于平緩。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，應(yīng)用L18(36)正交表，考察萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、夾帶劑用量和CO2流量6個(gè)因素對(duì)提取量的全面影響。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，方差分析如表2所示。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)核桃青皮多酚提取量影響順序大小為：萃取溫度＞CO2流量＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞萃取壓力＞夾帶劑用量＞萃取時(shí)間。最優(yōu)萃取條件為：萃取溫度50 ℃、萃取壓力30 MPa、萃取時(shí)間6 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、夾帶劑用量3 mL/g、CO2流量30 kg/h。此最佳條件在正交試驗(yàn)中未出現(xiàn)過，所以需要在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過3次重復(fù)試驗(yàn)，得到的平均提取量為8.83 mg/g。

圖6 夾帶劑用量單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖7 CO2流量單因素試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

方差分析結(jié)果表明，各因素F值也顯示影響提取量大小順序?yàn)椋狠腿囟龋綜O2流量＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞萃取壓力＞夾帶劑用量＞萃取時(shí)間。這與表1分析結(jié)果一致，且萃取溫度對(duì)提取量影響最顯著（p＜0.05）。

2.3 體內(nèi)抗氧化活性

2.3.1 MDA含量

如圖8所示，與對(duì)照組相比較，核桃青皮多酚提取物和VC均可以減少M(fèi)DA含量（p＜0.05）。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，對(duì)機(jī)體造成不同程度的損傷。核桃青皮多酚提取物可以顯著降低機(jī)體MDA含量，表明其可以降低機(jī)體由脂質(zhì)自由基引起的損害。

圖8 不同樣品對(duì)小鼠MDA含量的影響

2.3.2 SOD活性

如圖9所示，核桃青皮多酚提取物和VC均顯著地增強(qiáng)了SOD活性（p＜0.05）。SOD可以將O2-·還原為H2O2和O2，GSH-PX可將有機(jī)過氧化物和H2O2還原為水和無毒物質(zhì)，因此SOD可以保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷。核桃青皮多酚提取物可以顯著提高SOD活性，表明其可以通過提高SOD活性提高機(jī)體清除自由基的能力。

2.3.3 GSH-PX活性

如圖10所示，VC可以顯著增強(qiáng)GSH-PX活性（p＜0.05），而核桃青皮多酚提取物對(duì)GSH-PX活性的影響并不顯著（p＞0.05）。GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，可以清除由活性氧和·OH誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，進(jìn)而有效防止機(jī)體損傷。與對(duì)照組相比較，核桃青皮多酚提取物可以提高GSH-PX活性，但效果不是很顯著，表明其通過提高GSH-PX活性從而提高機(jī)體保護(hù)能力的作用不明顯。

圖9 不同樣品對(duì)小鼠SOD活性的影響

圖10 不同產(chǎn)物對(duì)小鼠GSH-PX活性的影響

3 結(jié)論

結(jié)果顯示，超臨界二氧化碳提取核桃青皮多酚最優(yōu)提取條件為：萃取溫度50 ℃、萃取壓力30 MPa、萃取時(shí)間6 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、夾帶劑用量3 mL/g、CO2流量30 kg/h。在此最優(yōu)條件下提取量可以達(dá)到8.83 mg/g，各因素對(duì)提取量影響順序?yàn)椋狠腿囟龋綜O2流量＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞萃取壓力＞夾帶劑用量＞萃取時(shí)間。提取物可以顯著降低小鼠丙二醛（MDA）含量（p＜0.05）、提高超氧化物歧化酶（SOD）活性（p＜0.05），展現(xiàn)較為顯著的體內(nèi)抗氧化活性。