響應(yīng)面法優(yōu)化丹酚酸B提取工藝

趙孟浩，孫國(guó)杰*

河北科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院（石家莊 050018）

丹參是唇形科多年生草本植物。丹參中含有兩類主要成分，一類是脂溶性的丹參酮類，另一類是水溶性的丹酚酸類。丹酚酸類物質(zhì)中以丹酚酸B為主要成分。通過試驗(yàn)表明丹酚酸B具有保護(hù)心肌，抗肝纖維化的藥理作用，已被廣泛應(yīng)用于心腦血管等多種疾病的治療[1]。丹酚酸B是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的天然產(chǎn)物之一[2]。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)與傳統(tǒng)的均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面法具有試驗(yàn)精度高、試驗(yàn)次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)[3]。對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行全面研究，通過回歸方程分析和圖形分析[4]，得到最佳優(yōu)化條件。因此，通過響應(yīng)面法優(yōu)化丹酚酸B提取工藝，為更加高效提取丹酚酸B提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters 1525高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；UPR-11-10 T優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；JJ 200型天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；GM-0.33 II隔膜真空泵（天津市金騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；PL 203電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ 5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

紫花丹參（河北石家莊靈壽縣）；丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品（含量94.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（Fisher Chemical）；乙腈（Fisher Chemical）；超純水；磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 丹酚酸B的提取

將丹參避光陰干，粉碎，過3號(hào)篩（篩孔尺寸0.300 mm），精確稱取10 g于250 mL圓底燒瓶中，按照一定液料比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行加熱回流提取，提取1次。提取后用濾紙過濾。得到樣品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

將1.3.1小節(jié)得到的樣品溶液用水定容至500 mL，過0.22 μm的濾膜，得到供試品溶液。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定丹酚酸B對(duì)照品適量，加甲醇制備成質(zhì)量濃度為1.006 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.4 丹酚酸B的含量測(cè)定

1.3.4.1 色譜條件

色譜條件參照藥典[5]。色譜柱：Waters Symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水。梯度洗脫程序：0～15 min，17%～23%乙腈，15～30 min，23%～25%乙腈，30～40 min，25%～90%乙腈。流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將1.006 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)稀釋成0.503，0.402，0.302和0.201 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

稱取10 g丹參粉末，其他因素不變情況下，分別考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)丹酚酸B的提取量的影響。篩選出各因素的最佳條件。試驗(yàn)中料液比用丹酚酸B含量為縱坐標(biāo)，提取溫度和提取時(shí)間則采用峰面積做縱坐標(biāo)。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的單因素范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，因素及水平見表1。

1.3.7 驗(yàn)證工藝

選取響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最優(yōu)提取工藝，平行3組，計(jì)算丹酚酸B的質(zhì)量，以確定丹酚酸B的最優(yōu)提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相圖譜

丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品和供試品色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖2 丹酚酸B供試品圖譜

2.2 提取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定料液比1︰10（g/mL），提取時(shí)間60 min，考察提取溫度60，70，80和

90 ℃對(duì)丹酚酸B的提取量影響。如圖3所示，縱坐標(biāo)為待測(cè)樣品的峰面積。在80℃時(shí)有最大峰面積，即在相同條件下80 ℃提取的丹酚酸B量最多。

2.3 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定提取溫度80 ℃，提取60 min，提取1次，考察料液比1︰8，1︰10，1︰12，1︰15，1︰20，1︰40和1︰80 g/mL。如圖4所示，料液比1︰15 g/mL時(shí)有最大值，當(dāng)水量繼續(xù)增加，提取含量呈下降趨勢(shì)，到1︰40 g/mL之后，丹酚酸B含量基本不變。

圖3 提取溫度對(duì)丹酚酸B提取量的影響

圖4 料液比對(duì)丹酚酸B提取量的影響

2.4 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定料液比1︰10 g/mL，提取溫度80 ℃，考察提取時(shí)間20，30，60，90和120 min時(shí)的丹酚酸B提取量。如圖5所示，縱坐標(biāo)為供試品中丹酚酸B的峰面積，提取時(shí)間在20和30 min時(shí)，丹酚酸B的提取量最大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，丹酚酸B的提取量呈下降趨勢(shì)。隨著時(shí)間增加，丹酚酸B在水溶液中開始慢慢降解，這與其他研究得到的丹酚酸B降解理論一致，丹酚酸B的提取不能采用長(zhǎng)時(shí)間加熱。Y=27.24+1.26A-1.67B+3.62C-0.12AB+0.31AC+0.28BC-1.02A2-0.077B2-3.37C2。R2=0.986 9，R2adj=0.970 0。

圖5 提取時(shí)間對(duì)丹酚酸B提取量的影響

表2 丹酚酸B提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表3中的方差分析可知，模型p＜0.000 1，說明以響應(yīng)值（丹酚酸B提取量）建立的回歸模型極顯著。相關(guān)系數(shù)R2=0.986 9，修正系數(shù)R2adj=0.970 0，表明模型的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值吻合，失擬項(xiàng)p＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明二元多項(xiàng)式對(duì)試驗(yàn)中的擬合較好。A、B、C、C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），A2、B2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（p＜0.05）。

表3 模型回歸方程方差分析

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)軟件Design Expert 8.0.5分析，丹酚酸B提取量與料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）的二元多項(xiàng)式模型為

2.5.2 響應(yīng)面圖分析及優(yōu)化

根據(jù)模型繪制出各因素的等高線和響應(yīng)面，如圖6～圖8所示，兩兩因素繪制的影響面平緩，可知兩兩因素的交互作用不顯著，這與回歸方程分析給出的結(jié)果一致。

2.6 驗(yàn)證工藝

根據(jù)軟件Design-Expert 8.0.5預(yù)測(cè)的丹酚酸B提取最佳工藝為料液比1∶19.04 g/mL，提取時(shí)間20 min，提取溫度85.31 ℃?？紤]到實(shí)際操作，各因素修正為：料液比1∶19 g/mL，提取時(shí)間20 min，提取溫度85 ℃，平行3次試驗(yàn)，得到丹酚酸B提取量為29.12 mg/g與理論值29.57 mg/g接近。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化的丹酚酸B提取工藝可行。

圖6 提取時(shí)間和料液比對(duì)丹酚酸B提取量影響的等高線和響應(yīng)面

圖7 提取溫度和料液比對(duì)丹酚酸B提取量影響的等高線和響應(yīng)面

圖8 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)丹酚酸B提取量影響的等高線和響應(yīng)面

3 結(jié)論與討論

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化丹酚酸B的提取工藝，結(jié)果表明，建立的二元多項(xiàng)回歸方程擬合度好，該工藝穩(wěn)定可行。在該工藝的試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，提取溫度對(duì)于試驗(yàn)的結(jié)果相比較其他因素影響更加明顯。在對(duì)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，較低溫度時(shí)丹參提取液很難抽濾，檢測(cè)出丹酚酸B含量較低。這與王萍等得到的結(jié)果一致[6]。劉佳妮等[7]在試驗(yàn)中指出，70 ℃之前丹參多糖含量逐漸增加，70 ℃之后開始減少。這可能是在較低溫度下提取物含有大量多糖，使得溶液黏性增大，流動(dòng)性差，導(dǎo)致丹酚酸B提取不充分。具體原因還需要更多試驗(yàn)數(shù)據(jù)來說明。通過該試驗(yàn)，為丹酚酸B的提取及更好的開發(fā)利用丹酚酸B提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。