H2O2氧化對肉牛血紅素蛋白構(gòu)象與氧化性質(zhì)的影響

陳皓，馬國源，姬曉穎，張晴，馬君義，余群力*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(青海百德投資發(fā)展有限公司，青海 西寧，810000)

在牛肉加工保藏的過程中，其品質(zhì)受脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化的影響較大。目前，對于牛肉脂質(zhì)氧化的研究和報(bào)道較多，吳寶森等[1]研究發(fā)現(xiàn)，牛肉組織中的亞鐵血紅素、金屬離子和脂肪酸等促氧化因子均可以誘發(fā)蛋白質(zhì)的氧化。同時(shí)，蛋白質(zhì)的氧化也與自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)有密切的關(guān)系[2]。蛋白質(zhì)中的主鏈和側(cè)鏈均易受到自由基如硝基自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基等的攻擊[3]，從而引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步引起了蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生變化。這些變化不但會(huì)引起肌肉特性的改變，還會(huì)引起肉品質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和加工特性的改變[4]。因此，研究蛋白質(zhì)氧化對肉品的品質(zhì)影響意義重大。

我國肉牛產(chǎn)業(yè)逐漸成為畜牧業(yè)中的重要產(chǎn)業(yè)之一[5]，2017年肉牛存欄數(shù)量穩(wěn)定在1.0億頭以上。隨著存欄量和產(chǎn)量的上升，牛肉的品質(zhì)也在不斷提高。由于冷卻肉的品質(zhì)要優(yōu)于冷凍肉和熱鮮肉，所以冷卻肉會(huì)成為消費(fèi)市場的主流[6]。但其在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏和銷售過程中易受到光照、溫度和氧氣的影響，會(huì)造成肉品脂質(zhì)和蛋白的氧化，進(jìn)而影響肉品品質(zhì)。拉曼光譜是一種非彈性散射光，它與分子或晶格的振動(dòng)相關(guān)，所以常用于分子結(jié)構(gòu)的分析，是測定多肽和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最有效最快捷的方式之一[8]。二硫鍵是一種比較穩(wěn)定的共價(jià)鍵，它可以穩(wěn)定肽鏈的空間結(jié)構(gòu)。同時(shí)，二硫鍵數(shù)目越多，蛋白質(zhì)對抗外界影響的穩(wěn)定性越大[9]。由于二硫鍵的構(gòu)型不同，可以引起二硫鍵所在位置的2個(gè)半胱氨酸殘基的肽鏈相對構(gòu)象發(fā)生改變，所以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變[10]。在使用強(qiáng)氧化劑時(shí)，強(qiáng)氧化劑可將形成的二硫鍵再次氧化為游離巰基[11]。NO自由基近些年備受關(guān)注，NO自由基具有多方面的重要作用，一方面是內(nèi)皮細(xì)胞的松弛因子，可以松弛血管平滑肌，同時(shí)還可以防止血小板凝聚，另一方面也是一種神經(jīng)傳導(dǎo)的逆信使。機(jī)體自身會(huì)釋放大量的NO自由基來殺傷侵入的腫瘤細(xì)胞或微生物，但是也可以損傷自身的正常細(xì)胞，對心肌和腦組織的損傷作用尤為明顯[12]。SOD是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，其特殊的生理活性決定了它是清除氧自由基的首要物質(zhì)。SOD不但能阻斷氧自由基對細(xì)胞造成損傷，還能及時(shí)修復(fù)受損的細(xì)胞，并復(fù)原自由基對細(xì)胞的損傷[13]。

本實(shí)驗(yàn)采用H2O2氧化體系，以拉曼光譜分析卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)變化和紅外光譜分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，并結(jié)合血紅素蛋白的二硫鍵、NO自由基和SOD活性為指標(biāo)，來探究氧化對牛肉血紅素蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能引起的改變。為從分子結(jié)構(gòu)的改變闡明牛肉蛋白質(zhì)氧化的規(guī)律提供了理論基礎(chǔ)，并為研究新的抗氧化劑、針對性保藏技術(shù)、延長儲(chǔ)藏期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：36月齡公牛背最長肌。

試劑：H202，分析純，成都市科龍化工試劑廠；NaNO2，分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；Tris-HCl、NTSB、EDTA、硫氰酸胍、甘氨酸、亞硫酸鈉、Na3PO4，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NO自由基試劑盒，南京建成科技有限公司；SOD試劑盒，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHALI-4 LD型真空冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST公司；HR 800型激光顯微拉曼光譜儀，法國HORIBA公司；WQF-400 N型傅里葉變換近紅外光譜儀，北京第二光學(xué)儀器廠；TGL-24 MC型高速冷凍離心機(jī)，平凡儀器廠；HI 99163型pH計(jì)，哈納沃德儀器(北京)有限公司；XHF-D型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；756 P紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考LU等[14]、王麗麗等[15]的方法，并略作修改。使用牛背最長肌提取血紅素蛋白，并進(jìn)行分離純化。向血紅素蛋白提取液中加入等體積的50 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液，并向該體系中加入與提取液等體積的0、10和20 mmol/L的H2O2；25 ℃條件下反應(yīng)24 h，使用與提取液等體積的EDTA終止氧化反應(yīng)。之后將部分氧化體系溶液凍干成粉末用作光譜測定[16]，其余樣品置于凍樣管中-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.4 結(jié)構(gòu)測定

1.4.1 卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)測定

參考LU等[17]方法，并略作修改。將凍干24 h的H2O2氧化后的血紅素蛋白分別放在拉曼光譜儀下，激光波長532 nm，功率7.63 mW，狹縫寬度200 μm，光柵密度選擇400 grades/cm，掃描范圍為100～1 800 cm-1，每次掃描時(shí)間為20 s，積分3次，以苯丙氨酸為歸一化因子。提取1 200～1 700 cm-1波段，對卟啉環(huán)中心尺寸進(jìn)行分析。

1.4.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)測定

參考PRIM等[18]的方法，并略作修改。將凍干24 h的未處理血紅素蛋白和H2O2氧化后的血紅素蛋白置于光譜儀室平衡12 h，使得樣品環(huán)境條件與光譜儀的條件一致。光譜儀分辨率為2 cm-1，全波段掃描，掃描次數(shù)64次；提取1600～1 700 cm-1波段，進(jìn)行高斯擬合，對二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在得到原始光譜圖后，使用Origin 8.0軟件對原始圖譜進(jìn)行去積卷，然后使用LabSpec軟件去除其他干擾[19]。紅外光譜可以清晰地定量反應(yīng)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，使用PeakFit 4.0軟件對1 600～1 700 cm-1處譜圖先進(jìn)行基線校準(zhǔn)、去積卷，再進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，并利用各子峰面積計(jì)算出各部分二級(jí)結(jié)構(gòu)的比率[20]。

1.5 氧化性質(zhì)測定

1.5.1 二硫鍵含量

參考THANNHAUSER等[21]的方法加以優(yōu)化進(jìn)行測定。稱取100 mg 5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-dithiobis(2-nitrobenozic acid))溶于10 mL 1 mol/L Na2SO3溶液中，調(diào)節(jié)pH值為7.25，將盛有溶液的燒杯至于38 ℃水浴鍋中，加熱1 h后與溶液(2 mol/L硫氰酸胍，50 mmol/L甘氨酸，100 mmol/L亞硫酸鈉，3 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminete traacetic acid)，pH 9.5)按1∶100混合，所得溶液即為2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸鹽(2-nitro-5-thiosulfobenzoate)試劑。將血紅素蛋白分散在25 mmol/L磷酸鈉緩沖液中(pH=6.25)，調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。取100 μL稀釋后的蛋白液與3 mL新鮮配制的NTSB溶液混合，在室溫避光反應(yīng)25 min，然后在412 nm下測定吸光值A(chǔ)。100 μL 25 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.25)代替蛋白液用于空白對照。使用分子吸光系數(shù)13 600 mol/(L·cm)計(jì)算二硫鍵含量，每個(gè)樣本3個(gè)平行。

(1)

式中：A，吸光度；ε，摩爾消光系數(shù)。

1.5.2 NO自由基含量

參照南京建成NO自由基測定試劑盒說明書中方法進(jìn)行測定。

(2)

1.5.3 SOD活性

參照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司SOD試劑盒說明書測定。

樣品稀釋倍數(shù)

(3)

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的Duncan’s法(P<0.05)檢驗(yàn),并進(jìn)行顯著性分析；數(shù)據(jù)繪圖使用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅素蛋白卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)變化

蛋白質(zhì)的構(gòu)型或者構(gòu)象的變化可以引起拉曼光譜吸收峰位置、強(qiáng)度和退偏比的變化，從而可以反映出酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ帶的變化及二級(jí)結(jié)構(gòu)信息的變化和酪氨酸、色氨酸等側(cè)鏈的構(gòu)象信息[22]以及其對于血紅素環(huán)骨架的振動(dòng)模式。圖1為不同濃度處理血紅素蛋白的拉曼光譜圖。

圖1 不同濃度雙氧水處理的血紅素蛋白拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of heme protein treated with differentconcentrations of hydrogen peroxide

血紅素中心尺寸和卟啉環(huán)間距主要由處于1 470～1 600 cm-1附近的譜帶來確定，該區(qū)間是鐵離子自旋態(tài)的敏感譜帶，受血紅素環(huán)內(nèi)電子密度的影響較小，受次甲基鍵伸縮振動(dòng)的影響較大[23]。由圖1和表1分析可得，H2O2氧化處理后血紅素的中心尺寸及卟啉環(huán)間距發(fā)生了變化。一般來說，1 470～1 505 cm-1為Cα-Cβ和Cα-Cm的拉伸模式，1 560～1 600 cm-1為Cβ-Cβ的拉伸模式。當(dāng)使用H2O2氧化血紅素蛋白后，可以發(fā)現(xiàn)該譜帶峰值降低，且峰值區(qū)間左移，可以推測Fe2+的低自旋態(tài)變?yōu)镕e3+的高自旋態(tài)，氧化時(shí)，F(xiàn)e與吡咯環(huán)的N原子距離增大，鍵長增長，血紅素中心尺寸增大[24]。同時(shí)，dx2-y2的反鍵軌道電子密度增高。所以，Cα-Cm、Cα-Cβ、Cβ-Cβ的鍵長均增長[25]。

由上述分析可知，在氧化過程中，由于卟啉環(huán)中C原子間間距變大，C—C鍵鍵長增長，卟啉結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張，中心Fe原子更加接近于卟啉環(huán)平面，此時(shí)，空間位阻和電子軌道能級(jí)躍遷的協(xié)同效應(yīng)，二價(jià)鐵由低自旋態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r(jià)鐵的高自旋態(tài)[26]。使得血紅素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生細(xì)微變化，從而引起了血紅蛋白的功能變化。此時(shí)，血紅素蛋白的攜氧機(jī)制喪失，同時(shí)，血紅素蛋白的抗氧化性也會(huì)發(fā)生改變。

2.2 血紅素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈的各種折疊方式，比如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲[27]。這些結(jié)構(gòu)主要由酰胺Ⅰ帶的譜峰指認(rèn)，其中α-螺旋為1 650～1 658 cm-1、β-折疊為1 610～1 640 cm-1、β-轉(zhuǎn)角為1 660～1 700 cm-1、無規(guī)則卷曲為1 640～1 650 cm-1[28]。酰胺Ⅰ帶的譜峰指認(rèn)目前已比較成熟且應(yīng)用廣泛。

表1 不同濃度雙氧水處理的血紅素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 1 Changes of secondary structure of heme proteintreated with different concentrations of hydrogen peroxide

注：小寫字母代表不同處理組間差異顯著(P<0.05)，下同。

從表1可以看出，在血紅素蛋白中主要是α-螺旋和β-折疊為主。H2O2處理時(shí)可能是蛋白質(zhì)的收縮破壞了多肽鏈的反轉(zhuǎn)，使其α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊的收縮結(jié)構(gòu)，這使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨向穩(wěn)定[28]。多肽鏈反轉(zhuǎn)180°形成了β-轉(zhuǎn)角，H2O2的加入大幅度改變了肽鏈的結(jié)構(gòu)，形成β-轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基因?yàn)镠2O2的氧化而增加，使其β-轉(zhuǎn)角含量增加[29]。同樣，由于α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基因?yàn)镠2O2的氧化破壞了其旋轉(zhuǎn)，使其轉(zhuǎn)化為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)[30]。但從構(gòu)象角度來說，β-轉(zhuǎn)角的空間位阻要比α-螺旋要小，所以H2O2會(huì)更加容易與β-轉(zhuǎn)角中的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)[31]。此時(shí)又由于α-螺旋中巰基易被氧化形成二硫鍵，所以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角會(huì)明顯增加。

綜上分析可知，H2O2處理可以使α-螺旋下降7.3%、β-折疊上升12.03%、無規(guī)則卷曲下降9.66%。從而明顯改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得其功能性質(zhì)發(fā)生了改變。

2.3 H2O2處理對血紅素蛋白功能特性的影響

2.3.1 二硫鍵含量

蛋白質(zhì)的氧化會(huì)使得肽鏈上的巰基交聯(lián)形成二硫鍵，通常，蛋白質(zhì)的氧化程度越高，其巰基含量越低，二硫鍵含量越高[32]。由圖2可以看出，在使用10 mmol/L H2O2氧化時(shí)，二硫鍵含量比使用0 mmol/L H2O2氧化時(shí)顯著上升30.77%；而使用20 mmol/L H2O2氧化時(shí)，二硫鍵含量比使用0 mmol/L H2O2氧化時(shí)顯著上升56.67%，比使用10 mmol/L H2O2氧化時(shí)顯著上升43.33%。在整個(gè)氧化過程中，由于氧化劑用量和氧化時(shí)間相同，所以氧化劑濃度是蛋白氧化程度的決定因素。故在氧化劑濃度增大時(shí)，蛋白質(zhì)氧化會(huì)更加徹底，從而使其中巰基交聯(lián)成二硫鍵，使其含量顯著升高[33]。

圖2 不同濃度雙氧水處理的血紅素蛋白二硫鍵含量變化Fig.2 Changes in the disulfide bond content of heme protein treated with different concentrations of hydrogen peroxide

2.3.2 NO自由基含量

NO自由基對細(xì)胞有雙重作用，可以介導(dǎo)一系列生化反應(yīng)，從而使細(xì)胞凋亡[34]。由圖3可以看出，在使用濃度為0 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化時(shí)，其NO自由基含量為4.976 μmol/g；在使用濃度為10 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化時(shí)，其NO自由基含量為5.011 μmol/g；在使用濃度為20 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化時(shí)，其NO自由基含量為12.054 μmol/g。由此可以看出在使用低劑量H2O2氧化血紅素蛋白時(shí)，NO自由基含量上升不顯著，但在使用高劑量H2O2對血紅素蛋白氧化時(shí)，其NO自由基含量顯著上升。

圖3 不同濃度雙氧水處理的血紅素蛋白NO自由基含量變化Fig.3 Change of No free radical content of heme protein treated with different concentrations of hydrogen peroxide

2.3.3 SOD活性

SOD能夠清除生物體在新陳代謝中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，尤其是超氧陰離子自由基，具有抗氧化、抗衰老的效果[35]。由圖4可以看出，當(dāng)使用濃度為0 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化時(shí)，其SOD活性為0.153 U/mg；在使用濃度為10 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化時(shí)，其SOD活性為0.159 U/mg；在使用濃度為20 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化時(shí)，其SOD活性為0.132 U/mg。在使用低劑量氧化劑氧化時(shí)，SOD活性會(huì)有略微上升，但在使用高劑量氧化劑進(jìn)行氧化時(shí)，SOD的活性反而下降。由此可以推測，在使用低劑量氧化劑對血紅素蛋白進(jìn)行氧化時(shí)，其SOD活性受誘導(dǎo)效應(yīng)產(chǎn)生應(yīng)激性而略微升高[36]。隨著H2O2濃度的升高，SOD活性降低，此時(shí)血紅素蛋白抗氧化還原防御能力降低。

圖4 不同濃度雙氧水處理的血紅素蛋白SOD活性變化Fig.4 Change of SOD activity of heme protein treated with different concentrations of hydrogen peroxide

3 結(jié)論

拉曼光譜結(jié)果表明，H2O2處理導(dǎo)致血紅素蛋白中卟啉環(huán)的整體擴(kuò)張，使得中心Fe更接近卟啉平面，并且Fe的氧化態(tài)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)發(fā)生了改變。H2O2處理導(dǎo)致血紅素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，樣品氧化后，α-螺旋下降7.37%，β-折疊上升5%，β-轉(zhuǎn)角上升12.03%，無規(guī)則卷曲下降9.66%。同時(shí)，在氧化后二硫鍵含量顯著升高，此時(shí)，原本疏松的蛋白折疊結(jié)構(gòu)變得更加緊密。從而使蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)發(fā)生改變。

H2O2處理導(dǎo)致血紅素蛋白氧化后，NO自由基含量明顯升高，它可以同血紅素蛋白形成較強(qiáng)的配位結(jié)合，并將Fe(Ⅱ)或Fe(Ⅲ)上的O2或者CO取代下來，從而使血紅素蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，其自身的攜氧機(jī)制喪失。H2O2處理導(dǎo)致血紅素蛋白氧化后，SOD活性先略微升高后顯著降低，其抗氧化能力降低。H2O2處理導(dǎo)致血紅素蛋白卟啉環(huán)、二硫鍵和二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而使得血紅素蛋白的性質(zhì)發(fā)生了改變。