電針復(fù)合七氟烷麻醉干預(yù)斷尾大鼠核c-fos蛋白表達(dá)的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制

彭昌梅,趙俊鶯,王艷

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電針復(fù)合七氟烷麻醉干預(yù)斷尾大鼠核c-fos蛋白表達(dá)的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制

彭昌梅1,趙俊鶯2,王艷3

(1.重慶開(kāi)州光明骨科醫(yī)院,重慶 405400;2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,西安 710077;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,重慶 400010)

分析電針復(fù)合七氟烷麻醉干預(yù)斷尾大鼠核c-fos蛋白表達(dá)的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制,為臨床患者診療提供一些實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。50只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠,隨機(jī)分為麻醉組、針刺組、觀察組、對(duì)照組與正常組,每組10只。除正常組外,其他各組大鼠制備急性應(yīng)激模型,麻醉組和觀察組大鼠行七氟烷麻醉,針刺組和觀察組大鼠行電針治療,對(duì)照組和正常組大鼠不進(jìn)行任何干預(yù)。采用ELISA法檢測(cè)血清皮質(zhì)酮(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量,Western blot檢測(cè)大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)狀況,流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群含量。與正常組比較,對(duì)照組大鼠血清CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表達(dá)上升(＜0.05);與對(duì)照組比較,針刺組、麻醉組及觀察組大鼠CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表達(dá)下降(＜0.05);與針刺組、麻醉組比較,觀察組大鼠血清CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表達(dá)下降(＜0.05)。與正常組比較,對(duì)照組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降(＜0.05);與對(duì)照組比較,針刺組和觀察組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升(＜0.05)。電針復(fù)合七氟烷麻醉可顯著改善斷尾大鼠機(jī)體應(yīng)激狀況,降低核c-fos蛋白分泌和血清ACTH、CORT含量,提升大鼠機(jī)體免疫功能。

針刺療法;電針;應(yīng)激;c-fos蛋白;大鼠

應(yīng)激為機(jī)體對(duì)于不同刺激所形成的非特異性反應(yīng),一般經(jīng)過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸所產(chǎn)生應(yīng)激激素來(lái)適應(yīng)并調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)[1-2]。血清皮質(zhì)酮(CORT)與促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量為HPA調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)的主要外周指標(biāo),而中樞調(diào)控應(yīng)激敏感因子為c-fos蛋白。全身麻醉結(jié)合電針能夠使肺切除患者在圍手術(shù)期內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)下降,頸叢阻滯結(jié)合電針也可以使甲狀腺患者在圍手術(shù)期內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)下降[3-4]。因此,本研究經(jīng)過(guò)分析電針復(fù)合七氟烷麻醉對(duì)斷尾大鼠核c-fos蛋白分泌及應(yīng)激調(diào)控機(jī)制,為臨床患者診療提供一些實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠50只,6周齡,購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)為[SCXK(川):2018- 23],體質(zhì)量90～120 g,平均(113.51±12.39)g。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn),大鼠分籠飼養(yǎng),每個(gè)籠內(nèi)5只,室溫維持在22℃～26℃,相對(duì)濕度在55%～65%,晝夜循環(huán),保持12 h光照,大鼠添加飼料及換水等都由專(zhuān)人進(jìn)行。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

SAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司), CORT、ACTH試劑盒(華美Cusabio公司),鼠抗b-actin (北京中杉金橋公司生產(chǎn),1:1000),兔抗人多克隆c-fos抗體(美國(guó)Santa Cruz公司,1:1000),DAB(美國(guó)Sigma公司),山羊抗兔辣根標(biāo)記二抗(美國(guó)Sigma公司, 1:5000)、山羊抗小鼠辣根標(biāo)記二抗(美國(guó)Sigma公司, 1:5000)。

1.2.2 主要儀器

IPP6.0凝膠成像系統(tǒng)、麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀(美國(guó)Datex-Ohmeda公司),華佗牌電子診療儀(蘇州醫(yī)療用品廠,型號(hào)SDZ-Ⅱ),ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾特生物公司),七氟烷揮發(fā)罐、Bio-Rad電轉(zhuǎn)膜儀及Bio- Rad蛋白電泳系統(tǒng)(美國(guó)Datex-Ohmeda公司)。

1.3 動(dòng)物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為麻醉組(10只)、針刺組(10只)、觀察組(10只)、對(duì)照組(10只)與正常組(10只)。

1.4 模型制備

除正常組外,其他各組大鼠依據(jù)Xu B等[5]方法使用低位尾干切斷(ICTR)法制備急性應(yīng)激模型,大鼠固定后,橫切尾端尾干部位(即S3與S4脊髓神經(jīng)間)。

1.5 干預(yù)方法

依據(jù)Lee HT等[6]實(shí)驗(yàn)方法,麻醉組和觀察組大鼠通入七氟烷(體積分?jǐn)?shù)為2%)。大鼠置入玻璃麻醉箱內(nèi),石灰鋪滿箱底,七氟烷使用Ohmeda揮發(fā)罐給予麻醉誘導(dǎo)與麻醉維持,氣管導(dǎo)管接至Datex麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀上,對(duì)呼氣末七氟烷含量監(jiān)測(cè),玻璃箱內(nèi)保持七氟烷含量在2%。同時(shí)對(duì)針刺組和觀察組大鼠行電針,在大鼠翻正反射消失以后,快速?gòu)穆樽硐鋬?nèi)取出,電針連接后再放入麻醉箱內(nèi)。依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]選取足三里所對(duì)應(yīng)后三里,在膝關(guān)節(jié)外側(cè)的腓骨小頭下緣5 mm位置脛腓骨之間,直刺7 mm,行疏密波,參數(shù)為3 Hz、3 V、 2 ms,電針刺激每30 min進(jìn)行1次,間隔30 min進(jìn)行,共行4次。對(duì)照組和正常組大鼠不進(jìn)行任何干預(yù)。大鼠在末次刺激后斷頸處死,取外周血6 mL,同時(shí)取下丘腦組織保存于液氮內(nèi)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清CORT、ACTH含量

各組大鼠外周血加入到抗凝管內(nèi),室溫放置2 h, 4000 r/min離心10 min后取上清液,ELISA法檢測(cè)血清CORT、ACTH含量,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加入至酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi),樣品加入到樣品孔內(nèi),每個(gè)孔內(nèi)10mL,膠紙將反應(yīng)孔封住,37℃下孵育2 h,洗板5次,再加入10mL生物素化抗體工作液,37℃下孵育1 h,洗板5次,加入10mL酶結(jié)合物工作液,37℃下避光孵育30 min,洗板5次,每孔加入10mL顯色液,37℃下避光孵育20 min,最后加入終止液,混勻后檢測(cè)OD450數(shù)值,標(biāo)準(zhǔn)品濃度當(dāng)做橫坐標(biāo),OD數(shù)值當(dāng)做縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)樣品OD數(shù)值于標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)查看其濃度。

1.6.2 大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測(cè),下丘腦加入比例為5mg/mL組織裂解液,勻漿以后離心機(jī)13000 r/min離心后選取上清液檢測(cè)其總蛋白含量。選取蛋白質(zhì)40mg,加熱變性,蛋白采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)采用電轉(zhuǎn)膜儀至聚二偏氟乙烯膜內(nèi),Tris緩沖液(含有0.1%Tween-20及10%脫脂奶粉)封閉1 h,而后行免疫雜交反應(yīng)。兔來(lái)源c-fos抗體1:1000加入,在4℃下孵育過(guò)夜。Tris緩沖液洗滌以后將羊抗兔二抗加入,滴度是1:5000,在室溫下孵育78 min。Tris緩沖液洗滌,暗室下降增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑加入,壓X線片。Western雜交膜將c-fos條帶顯示以后,PVDF膜使用Tris緩沖液洗滌30 min,b-actin條帶使用同樣方法顯示,當(dāng)做加樣內(nèi)參照。X線片內(nèi)條帶在經(jīng)過(guò)凝膠成像系統(tǒng)將灰度值讀取,定量。c-fos/b-actin條帶灰度數(shù)值對(duì)上樣量偏差進(jìn)行糾正, c-fos蛋白含量使用灰度比值表示。

1.6.3 T淋巴細(xì)胞亞群(CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢)含量

取大鼠外周血5 mL,抗凝后加入對(duì)應(yīng)熒光MoAb 10mL,避光放置20 min。再加入2 mL裂解液,搖勻后避光放置10 min,紅細(xì)胞全部裂解后離心機(jī)1200 r/min離心6 min,PBS洗滌3次后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群(CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清CORT、ACTH含量比較

與正常組比較,對(duì)照組大鼠血清CORT、ACTH含量上升(＜0.05);與對(duì)照組比較,針刺組、麻醉組及觀察組大鼠CORT、ACTH含量下降(＜0.05);與針刺組、麻醉組比較,觀察組大鼠血清COPR、ACTH含量下降(＜0.05)。詳見(jiàn)圖1。

注:與正常組比較1)P＜0.05;與對(duì)照組比較2)P＜0.05;與麻醉組比較3)P＜0.05;與針刺組比較4)P＜0.05

2.2 各組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)比較

與正常組比較,對(duì)照組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)上升(＜0.05);與對(duì)照組比較,針刺組、麻醉組及觀察組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)下降(＜0.05);與針刺組、麻醉組比較,觀察組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)下降(＜0.05)。詳見(jiàn)圖2-3。

圖2 各組大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)比較

注:與正常組比較1)P＜0.05;與對(duì)照組比較2)P＜0.05;與麻醉組比較3)P＜0.05;與針刺組比較4)P＜0.05

2.3 各組大鼠外周血清T淋巴細(xì)胞亞群含量比較

與正常組比較,對(duì)照組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降(＜0.05);與對(duì)照組比較,針刺組和觀察組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升(＜0.05)。詳見(jiàn)圖4。

注:與正常組比較1)P＜0.05;與對(duì)照組比較2)P＜0.05

3 討論

急性應(yīng)激一方面經(jīng)過(guò)交感神經(jīng)興奮,釋放兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì),可造成外周血內(nèi)血糖、CORT及ACTH等快速上升,另一方面可經(jīng)過(guò)傷害性感受器刺激各種炎性介質(zhì)釋放,如P物質(zhì)、組胺、緩激肽及前淚腺激素等,同時(shí)激活多種體液級(jí)聯(lián)系統(tǒng),抑制或者阻礙上述通路就可有效降低其應(yīng)激強(qiáng)度。臨床一般將機(jī)體神經(jīng)元興奮標(biāo)志視為c-fos蛋白表達(dá)狀況,若機(jī)體處于非應(yīng)激狀況,其腦部c-fos蛋白的表達(dá)含量非常低[8-9]。張?jiān)茤|等[10]研究顯示,機(jī)體受到創(chuàng)傷前期應(yīng)激狀況下下丘腦內(nèi)c-fos表達(dá)量迅速升高,而促腎上腺素釋放激素(CRH)表達(dá)則比c-fos表達(dá)略慢,這說(shuō)明在機(jī)體創(chuàng)傷以后應(yīng)激反應(yīng)下其下丘腦內(nèi)前期c-fos表達(dá)對(duì)CRH基因表達(dá)有激活影響。相關(guān)研究顯示,傳入急性疼痛應(yīng)激以后,下丘腦室旁核的c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄被激活,c-fos蛋白表達(dá),導(dǎo)致下丘腦釋放大量CRH到垂體內(nèi)并進(jìn)入血中,進(jìn)而使HPA軸啟動(dòng)[11-14]。

本研究顯示,觀察組和對(duì)照組大鼠進(jìn)行斷尾急性刺激以后,其血清內(nèi)CORT、ACTH含量快速上升,同時(shí)下丘腦內(nèi)c-fos表達(dá)量也上升,說(shuō)明急性應(yīng)激模型成功制備,而后對(duì)觀察組大鼠行七氟烷吸入聯(lián)合電針刺激,其下丘腦內(nèi)c-fos表達(dá)量下降,其作用機(jī)制可能為電針結(jié)合七氟烷可降低大鼠下丘腦內(nèi)激活c-fos神經(jīng)元,那么轉(zhuǎn)錄形成CRH數(shù)量也同樣降低。HPA軸被CRH激活后所釋放到血清內(nèi)ACTH含量下降,腎上腺皮質(zhì)受ACTH刺激所形成的CORT含量也隨之下降,交感神經(jīng)興奮通路抑制和傷害性感受器刺激各種炎性介質(zhì)釋放數(shù)量降低,從而起到降低應(yīng)激強(qiáng)度作用,患者應(yīng)激狀況得以調(diào)節(jié)。相關(guān)研究顯示,對(duì)神門(mén)、百會(huì)等穴位行電針刺激可使血清內(nèi)ACTH、CORT含量降低,其影響原理可能和電針對(duì)HPA軸功能調(diào)節(jié)有聯(lián)系,另外,臨床神經(jīng)外科手術(shù)中采用電針復(fù)合七氟烷麻醉也證明了其對(duì)患者術(shù)后前期恢復(fù)與鎮(zhèn)痛效果理想[15-16]。本研究顯示,觀察組大鼠在進(jìn)行電針和七氟烷麻醉影響后,其血清內(nèi)CORT、ACTH含量明顯降低,說(shuō)明七氟烷吸入麻醉結(jié)合電針調(diào)控應(yīng)激影響有效,同時(shí)觀察組大鼠下丘腦組織內(nèi)c-fos表達(dá)量下降也驗(yàn)證了HPA軸受下丘腦調(diào)控作用和c-fos表達(dá)量降低有緊密聯(lián)系。交感腎上腺素受興奮迷走膽堿能神經(jīng)纖維抑制,對(duì)激素含量改變有調(diào)整影響;同時(shí)還能夠?qū)㈡?zhèn)痛機(jī)制激活,痛覺(jué)信號(hào)傳遞受到抑制,進(jìn)而起到鎮(zhèn)痛影響,使患者疼痛所誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)下降[17-19]。機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)可經(jīng)過(guò)體液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)改變并影響機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別力,降低免疫功能。Keller T等[20]利用強(qiáng)度電刺激當(dāng)做應(yīng)激因子,發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可降低外周血內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目,血清內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化受到抑制,其抑制效應(yīng)和應(yīng)激強(qiáng)度成正比。T淋巴細(xì)胞為機(jī)體免疫功能最重要免疫細(xì)胞,其中CD3﹢反映了總T淋巴細(xì)胞水平,而CD4﹢、CD8﹢和CD4﹢/CD8﹢在一定程度內(nèi)可表示輔助性T淋巴細(xì)胞和抑制性T淋巴細(xì)胞及其比值。本文研究顯示,與正常組比較,對(duì)照組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降;與對(duì)照組比較,針刺組和觀察組大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),說(shuō)明在應(yīng)激狀態(tài)下大鼠免疫功能受到抑制,而針刺可有效改善大鼠因應(yīng)激所造成免疫功能抑制。

綜上所述,電針復(fù)合七氟烷麻醉可顯著改善斷尾大鼠機(jī)體應(yīng)激狀況,降低核c-fos蛋白分泌和血清ACTH、CORT含量,提升大鼠機(jī)體免疫功能。

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Stress-regulation Mechanism of Electroacupuncture plus Sevoflurane Anesthesia via Intervening Nuclear C-fos Protein Expression in Caudal Resection Rats

-1,-2,3.

1.,405400,; 2.’,’710077,; 3.,400010,

To analyze the stress-regulation mechanism of electroacupuncture plus sevoflurane anesthesia via intervening nuclear C-fos protein expression in caudal resection rats, and to provide laboratory evidence for the diagnosis and treatment in clinical practice.Fifty SPF-grade male Wistar rats were randomized into an anesthesia group, an acupuncture group, an observation group, a control group and a normal group, with 10 rats in each group. The rats were established into acute stress models except those in the normal group. Rats in the anesthesia group and observation group received sevoflurane anesthesia, the acupuncture group and observation group received electroacupuncture, and the control and normal groups did not receive any intervention. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of corticosterone (CORT) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) in serum; Western blot was adopted to examine the protein expression of C-fos in hypothalamus; flow cytometry apparatus was used to detect the T-lymphocyte subsets in peripheral blood.Compared with the normal group, the contents of CORT and ACTH in rat’s serum and the protein expression of C-fos increased in the control group (＜0.05); compared with the control group, the contents of CORT and ACTH and the protein expression of C-fos in the acupuncture group, anesthesia group and observation group decreased (＜0.05); compared with the acupuncture and anesthesia groups, the contents of CORT and ACTH in rat’s serum and the protein expression of C-fos declined in the observation group (＜0.05). Compared with the normal group, the contents of CD3﹢, CD4﹢, CD8﹢and CD4﹢/CD8﹢in serum declined in the control group (＜0.05); compared with the control group, the contents of serum CD3﹢, CD4﹢, CD8﹢and CD4﹢/CD8﹢increased in the acupuncture and observation groups (＜0.05).Electroacupunc- ture plus sevoflurane can significantly improve the stress state in caudal resection rats, down-regulate the secretion of nuclear C-fos protein and the contents of serum ACTH and CORT, and enhance the rat’s immune function.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Stress; C-fos protein; Rats

1005-0957(2019)05-0560-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.05.0560

2018-12-29

彭昌梅(1978—)女,主治醫(yī)師,Email:seainglong23@163.com