北疆棉區(qū)棉花黃萎病菌培養(yǎng)性狀及致病力分化

蔡夢(mèng)杭，徐 燦，劉 啟，俞 燕，黃家風(fēng)

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國(guó)最大的植棉區(qū)，也是全國(guó)黃萎病發(fā)病較重的地區(qū)。影響到新疆棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，需明確黃萎病菌(Verticilliumdahliae)在新疆棉田的分化及分布。研究新疆北疆棉區(qū)棉花黃萎病菌的致病類型培養(yǎng)特性及致病力分化對(duì)新疆棉花生產(chǎn)發(fā)展有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大麗輪枝菌變異性強(qiáng)，在與寄主協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，常發(fā)生生理分化，產(chǎn)生新的生理型或致病型[1]。1966年美國(guó)學(xué)者首次根據(jù)不同菌系對(duì)棉花致病的嚴(yán)重程度和癥狀類型，將大麗輪枝菌劃分為兩種致病類型：落葉型T-1(后改為T-9)和非落葉型菌系SS-4，落葉型致病力比非落葉型強(qiáng)10倍[2]。1982年姚耀文等[3]根據(jù)為害程度將我國(guó)棉花黃萎病菌劃分為強(qiáng)、中、弱3個(gè)生理型；朱荷琴等[4]2007～2008年的研究表明，我國(guó)棉花黃萎病菌的優(yōu)勢(shì)致病類型為中等致病力菌株，而新疆棉區(qū)的菌株以弱致病力菌株為優(yōu)勢(shì)類群。段維軍[1]、韓宏[5]、李國(guó)英[6]等研究表明，新疆棉花黃萎病菌致病力有明顯增強(qiáng)的趨勢(shì)。劉海洋等[7]研究發(fā)現(xiàn)，棉花黃萎病菌落葉型菌系已占37.3%。對(duì)于棉花大麗輪枝菌致病性的研究主要集中在致病類型(落葉型和非落葉型)和對(duì)寄主致病力強(qiáng)弱方面進(jìn)行劃分，而對(duì)于造成番茄黃萎病的番茄大麗輪枝菌，其致病類型的劃分主要根據(jù)是否介導(dǎo)含Ve1抗性基因的番茄產(chǎn)生抗性，分為1號(hào)生理小種(含Ave1基因)和2號(hào)生理小種，只有1號(hào)生理小種才能介導(dǎo)含Ve1抗性基因的番茄產(chǎn)生抗性[8]。除了致病性的分化，大麗輪枝菌的培養(yǎng)性狀也存在差異，根據(jù)PDA平板上的菌落培養(yǎng)性狀，大麗輪枝菌至少形成菌絲型、菌核型、中間型3種菌落形態(tài)，朱荷琴[9]等將全國(guó)主要棉區(qū)的棉花黃萎病菌在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀分為5個(gè)類型，新疆棉花黃萎病菌培養(yǎng)性狀變異最小，只表現(xiàn)一種培養(yǎng)類型?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆棉花黃萎病發(fā)展迅速，發(fā)病提前，研究新疆北疆棉區(qū)棉花黃萎病致病類型、培養(yǎng)特性及致病力分化。為害加重。研究北疆棉花黃萎病菌的致病類型、培養(yǎng)特性及致病力分化?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在北疆棉區(qū)采集棉花黃萎病病菌，進(jìn)行落葉型、非落葉型以及生理小種的鑒定、分析不同致病類型在田間的分布情況、選取代表菌株對(duì)其培養(yǎng)性狀及對(duì)棉花的致病力進(jìn)行比較分析。為大麗輪枝菌群體遺傳結(jié)構(gòu)和制定黃萎病防治措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2016年9月至2018年9月從新疆北部主要植棉區(qū)：伊犁、博樂(lè)、五家渠、石河子、奎屯、塔城發(fā)病棉田采集棉花黃萎病病株。以鄉(xiāng)/連為單位，選取不相鄰的3～5塊條田(經(jīng)緯度差異明顯)，隨機(jī)選取5株病樣，剪取病株根莖部30 cm待用。去除未分離到黃萎病菌的樣品后，每塊條田至少有3個(gè)黃萎病菌菌株，因此,共采集條田147塊，分離得到病樣644株。表1

表1 北疆主要棉區(qū)棉花黃萎病病株采集Table1 Collection of Verticillium wilt disease from the main cotton planting area in Northern Xinjiang

序號(hào)No.采集地Area具體地點(diǎn)Locations條田數(shù)Fields株數(shù)Total1伊犁Yili64團(tuán)4152博樂(lè)Bole83團(tuán)、89團(tuán)、金播種業(yè)試驗(yàn)田、五師客運(yùn)站旁7933五家渠Wujiaqu105團(tuán)、新湖農(nóng)場(chǎng)、芳草湖五場(chǎng)19554石河子Shizi121團(tuán)、133團(tuán)、144團(tuán)、147團(tuán)、148團(tuán)、149團(tuán)、150團(tuán)401785奎屯Kuytun123團(tuán)、124團(tuán)、125團(tuán)、126團(tuán)、127團(tuán)、128團(tuán)、129團(tuán)、130團(tuán)742886塔城Tacheng184團(tuán)315合計(jì)Total147644

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離與培養(yǎng)

在無(wú)菌操作環(huán)境下，將病株切取3 cm節(jié)段，去皮，先后于0.1%的升汞中浸洗50 s，75%酒精中浸洗30 s，再分別于3個(gè)無(wú)菌水中依次浸洗10 s，置于無(wú)菌濾紙上晾置2 min，切成1～2 mm厚度的圓片，斜插在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的平板中，24℃暗培養(yǎng)7～12 d。待菌絲、菌核長(zhǎng)出，根據(jù)菌落形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子特征初步鑒定為棉花黃萎病致病菌后，采用平板稀釋法單孢純化[10]后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 棉花黃萎病菌的分子檢測(cè)

將分離純化后的各供試菌株，在PDA培養(yǎng)基中24℃暗培養(yǎng)7 d后，刮取菌絲體及微菌核，液氮冷凍后研磨成細(xì)粉，使用由北京索萊寶科技公司的Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株基因組DNA。以供試菌株的基因組DNA為模板，先用大麗輪枝菌特異引物VDS-F/VDS-R[11]對(duì)所有樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增以確定分離的菌株是否是大麗輪枝菌；再分別用大麗輪枝菌落葉型菌系特異引物D1和D2、非落葉型菌系特異引物ND1和ND2對(duì)所有樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增以確定菌株的致病類型。根據(jù)各地區(qū)的樣品數(shù)量按比例選取代表菌株，分別用1號(hào)生理小種特異引物VdAve1F和VdAve1R[8]、2號(hào)生理小種特異引物VdR2F和VdR2[12]進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增以確定菌株的生理小種。引物由上海生工生物工程有限公司合成。表2

表2 棉花黃萎病菌PCR檢測(cè)所用引物
Table 2 The primers used in PCR detection forV.dahliaefrom cotton

引物名稱Primers引物序列Primer sequence產(chǎn)物(bp)The size of PCR Product VDS-F5-CGGTGACATAATACTGAGAG-3'VDS-R5-GACGATGCGGATTGAACGAA-3'520D15'-CATGTTGCTCTGTTGACTGG-3'D25'-GACACGGTATCTTTGCTGAA-3'548ND15-CAGGGGATACTGGTACGAGACG-3'ND25-ATGAGTATTGCCGATAAGAACA-3'1 500Vd Ave1F 5' -AAGGGGTCTTGCTAGGATGG- 3'Vd Ave1R5' -TGAAACACTTGTCCTCTTGCT- 3'700Vd R2F 5' -ACTTAACGAAAGCATGCGC- 3' Vd R2R5' -CTTGACTTGCCGGCTCC- 3'250

1.2.3 條田類型劃分

根據(jù)落葉型和非落葉型菌株在一塊條田中所占的比例將發(fā)病條田劃分為5種類型：I型：?jiǎn)我宦淙~型菌株分布的地塊，落葉型菌株所占比例是100%；II型：落葉型菌株占總菌株數(shù)的比例是50%～100%，非落葉型菌株占總菌株數(shù)的比例小于50%，即落葉型菌株分布占優(yōu)勢(shì)的地塊；III型：落葉型和非落葉型菌株所占比例各為50%；IV型：落葉型菌株占總菌株數(shù)的比例小于50%，非落葉型菌株占總菌株數(shù)的比例是50%～100%，即非落葉型菌株分布占優(yōu)勢(shì)的地塊；V型：?jiǎn)我环锹淙~型菌株分布的地塊，非落葉型所占比例是100%。

1.2.4 大麗輪枝菌培養(yǎng)特性分類

將病株中初分離獲得的菌株純化后，按照菌落生長(zhǎng)情況進(jìn)行初步歸類，再根據(jù)各地區(qū)采集的菌株數(shù)量按比例選取了18個(gè)菌株作為代表菌株進(jìn)行培養(yǎng)性狀的觀察。將18個(gè)供試菌株單胞純化后轉(zhuǎn)入PDA平板上，24℃黑暗培養(yǎng)7 d后，用滅菌牙簽挑取菌絲，置于PDA平板中心，每個(gè)菌株5個(gè)重復(fù)，24℃培養(yǎng)15 d后測(cè)量各菌系菌落直徑，采用Excel 2010和SPSS19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Tukey s-b(K)單因素ANOVA分析法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，顯著水平為0.05，同時(shí)觀察記載其菌落色澤、形態(tài)、氣生菌絲、微菌核的產(chǎn)生情況。18個(gè)菌株使用的 PDA 培養(yǎng)基為同一批制備，并保證培養(yǎng)條件完全一致。

1.2.5 致病性測(cè)定

種子處理、棉苗培育均參照段維軍[13]的方法進(jìn)行。將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株放入察氏液體培養(yǎng)基中24℃，200 r/min搖培5 d，4層紗布過(guò)濾收集菌株的分生孢子，用清水調(diào)整孢子濃度至1×107cfu/mL，采用孢子懸浮液浸根接種法[14]接種第3片真葉展開(kāi)的棉苗。開(kāi)始發(fā)病后，采用棉花苗期5級(jí)分級(jí)法進(jìn)行病情調(diào)查[15]，病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別為0級(jí)：健株；1級(jí)：1～2片子葉出現(xiàn)病狀；2級(jí)：1～2片真葉表現(xiàn)明顯病狀；3級(jí)：3片及3片以上真葉表現(xiàn)病狀；4級(jí)：植株生長(zhǎng)點(diǎn)死亡或全株枯死。每隔2 d 記錄病情指數(shù)，病情指數(shù)=[(1×1級(jí)發(fā)病株數(shù))+(2×2級(jí)發(fā)病株數(shù))+(3×3級(jí)發(fā)病株數(shù))+(4×4級(jí)發(fā)病株數(shù))]×100÷[總株數(shù)×4(即最高病級(jí))]。每個(gè)菌株接種3盒水培棉苗，每盒12株棉苗，共計(jì)36株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS對(duì)接種30 d的平均病指進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花黃萎病菌的分子鑒定

2.1.1 棉花黃萎病菌的種類鑒定

利用大麗輪枝菌特異引物 VDS-F/VDS-R，對(duì)分離獲得的644個(gè)菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，研究表明，644個(gè)菌株均能擴(kuò)增到約520 bp的目標(biāo)條帶(圖1A)，北疆各棉區(qū)發(fā)生的棉花黃萎病病原都是大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)。圖1

注：A：棉花黃萎病菌種的PCR鑒定，1～10分別是北疆各地的代表菌株，CK：陰性對(duì)照；B：棉花黃萎病菌落葉型和非落葉型致病類型的PCR鑒定，1～10分別是部分落葉型菌株的PCR鑒定，11～20分別是部分非落葉型菌株的PCR鑒定；C：棉花黃萎病菌生理小種的PCR鑒定，1～10分別是北疆各地的代表菌株；Vu：1號(hào)生理小種的陽(yáng)性對(duì)照

Note: A: PCR identification ofV.dahliaefrom cotton; 1-10: the representative strains ofV.dahliaecollected from Northern Xinjiang.B: PCR identification of pathogenic types ofV.dahliaefrom cotton; 1-10: PCR identification of defoliating strains; 11-20: PCR identification of non-defoliating strains.C: PCR identification of physiological races ofV.dahliaefrom cotton.1-10: the representative strains ofV.dahliaecollected from Northern Xinjiang.Vu: positive control of physiological races 1, CK: negative control

圖1 北疆棉花黃萎病菌的PCR鑒定
Fig.1 PCR identification ofV.dahliaefrom cotton in Northern Xinjiang

2.1.2 棉花黃萎病菌落葉型和非落葉型致病類型的PCR鑒定

研究表明，利用落葉型菌系特異引物D1和D2可從435個(gè)菌株中擴(kuò)增到約550 bp的目標(biāo)條帶(圖1B)，這些菌株為落葉型菌系，占總菌株的67.5%；利用非落葉型菌系特異引物ND1和ND2可從179個(gè)菌株中擴(kuò)增到約1 500 bp的目標(biāo)條帶(圖1B)，這些菌株為非落葉菌系，占總菌株的27.8%；30個(gè)菌株(占4.7%)用2對(duì)引物均擴(kuò)增不到任何目標(biāo)條帶，這30個(gè)大麗輪枝菌菌株不能用落葉型和非落葉型對(duì)其致病類型進(jìn)行歸類。北疆棉花黃萎病菌以落葉型菌系為 主要致病類型。圖1

研究表明，伊犁、博樂(lè)、五家渠、石河子、塔城的落葉型菌系所占比例分別為66.7%、84.9%、78.2%、80.9%和100%，表明這些地區(qū)的棉花黃萎病菌以落葉型大麗輪枝菌為優(yōu)勢(shì)菌系。奎屯地區(qū)落葉型和非落葉型菌系的比例分別為30.9%和65.7%，落葉型菌系所占比例明顯小于非落葉型菌系，奎屯棉花黃萎病菌以非落葉型大麗輪枝菌為優(yōu)勢(shì)菌系。表3

2.1.3 生理小種PCR鑒定

從644個(gè)供試菌株中，根據(jù)各地區(qū)的菌株數(shù)量按比例選取代表菌株，伊犁3個(gè)、博樂(lè)19個(gè)、五家渠11個(gè)、奎屯36個(gè)、石河子58個(gè)、塔城3個(gè)，共130個(gè)菌株，分別用1 號(hào)生理小種的特異引物和2號(hào)生理小種的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，130個(gè)菌株均可用2號(hào)生理小種的特異引物擴(kuò)增到約250 bp的目標(biāo)條帶，卻不能用1號(hào)生理小種的特異引物擴(kuò)增到任何條帶(圖1C)，表明棉花大麗輪枝菌均為2號(hào)生理小種。圖1

表3 落葉型和非落葉型菌株在北疆各棉區(qū)所占比例
Table 3 The proportion of defoliating and non-defoliating strains in cotton areas of Northern Xinjiang

地區(qū)Area落葉型菌系Defoliating strains非落葉菌系Non-defoliating strains無(wú)法確定Unable to determine個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion總數(shù)Total伊犁Yili1066.7533.30015博樂(lè)Bole7984.91415.10093五家渠Wujiaqu4378.2814.647.355奎屯Kuitun5530.911765.763.4178石河子Shihezi23380.93512.2206.9288塔城Tacheng15100.00000015合計(jì)Total43567.517927.8304.7644

2.2 落葉型和非落葉型菌系在田間分布

研究表明，5種類型的條田中，I型條田，即單一落葉型菌株發(fā)生的地塊數(shù)最多，占總地塊數(shù)的57.8%；II型、III生條田，分別占總地塊數(shù)的比例較少，但3類條田共占總地塊數(shù)的24.5%；V型條田，即單一非落葉型菌株發(fā)生的條田，占總地塊數(shù)的17.7%。該結(jié)果表明,單一落葉型菌株發(fā)生的地塊最多，其次是落葉型和非落葉型菌株混合發(fā)生的地塊，單一非落葉型菌株發(fā)生的地塊最少。I型和II型條田以落葉型菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，地塊數(shù)是103塊，占總地塊數(shù)的70.1%；IV和V型條田以非落葉型菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，它們的地塊數(shù)是36塊，占總地塊數(shù)的24.5%。表明田間地塊以落葉型菌株分布為主。伊犁、博樂(lè)、五家渠、石河子和塔城地區(qū)的棉田均以I型和II型條田為主，只有奎屯地區(qū)以IV和V型條田為主(占總地塊數(shù)的67.5%)。表4

表4 北疆棉花黃萎病菌落葉型和非落葉型菌系在田間地塊中分布

Table 4 Distribution of field plots with defoliation and non-defoliation strains in Northern Xinjiang

地區(qū)Area總地塊數(shù)Number of plotsI型II型III型IV型V型個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion個(gè)數(shù)Number占比(%)Proportion伊犁Yili4375.0000000125.0博樂(lè)Bole7228.6571.4000000五家渠Wujiaqu191473.7210.515.300210.5奎屯Kuytun40922.537.512.51025.01742.5石河子Shihezi745473.0810.868.10068.1塔城Tacheng33100000000合計(jì)Total1478557.81812.385.4106.82617.7

2.3 棉花黃萎病菌培養(yǎng)性狀測(cè)定

研究表明，供試菌株的菌落形態(tài)分成3類，菌絲型(VS)：菌絲發(fā)達(dá)，始終不產(chǎn)生黑色微菌核，菌落白色，BD-2和KD-4菌株的菌落形態(tài)屬于此類；中間型(VM)：菌絲發(fā)達(dá)，菌落白色，僅在菌落中間產(chǎn)生少量微菌核，SD-7和WD-3菌株的菌落屬于此類；菌核型(VH)：產(chǎn)生大量黑色微菌核，菌絲不明顯，菌落呈黑色，剩下的14個(gè)菌株的菌落形態(tài)均屬于此類。菌核型類型中，14個(gè)菌株又分化形成3種類型：VH-I型菌落，黑色菌落外圍有一圈較寬的白色菌絲圈環(huán)繞，呈同心圓狀，菌落表面有少量絨毛狀氣生菌絲；VH-II型菌落，黑色菌落外圍是一圈很細(xì)的白色菌絲圈，同心圓狀，菌落表面氣生菌絲稀疏，均勻分布或同心輪紋狀分布；VH-III型菌落，黑色的菌落表面白色氣生菌絲明顯，同心輪紋狀排列。北疆棉花黃萎病菌的培養(yǎng)性狀存在明顯分化，但以菌核型菌落為主要培養(yǎng)類型。

除菌落形態(tài)存在差異外，18個(gè)菌株的菌落生長(zhǎng)速度也存在一定差異,KND-2菌株的菌落生長(zhǎng)速度最快，形成的菌落直徑最大，SND-6菌株的菌落生長(zhǎng)速度最慢，形成的菌落直徑最小。產(chǎn)生同種菌落類型的菌株，其菌落生長(zhǎng)速度也存在差異，如VH-I類型中的KND-1和KND-2的菌落直徑明顯大于其它4個(gè)菌株的直徑，VH-III類型中的KD-3菌株的菌落直徑明顯大于SND-6菌株的菌落直徑。因此,從菌落生長(zhǎng)速度的差異也說(shuō)明北疆棉花黃萎病菌的培養(yǎng)性狀存在明顯分化。

將供試菌株的菌落類型與其致病類型進(jìn)行對(duì)應(yīng)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)非落葉型菌株中，4個(gè)菌株(WND-1、BND-1、KND-1和KND-2)的菌落形態(tài)是VH-I，1個(gè)菌株(SND-6)的菌落形態(tài)是VH-III；13個(gè)落葉型菌株中，2個(gè)菌株(BD-2和KD-4)的菌落形態(tài)是VS；2個(gè)菌株(SD-7和WD-3)的菌落形態(tài)是VM；2個(gè)菌株(WD-2和TD-1)的菌落形態(tài)是VH-I；6個(gè)菌株(YD-1、SD-1、SD-2、SD-3、SD-4和SD-5)的菌落形態(tài)是VH-II；1個(gè)菌株(KD-3)的菌落形態(tài)是VH-III。非落葉型菌株形成VH-I型菌落的比例較高，落葉型菌株可形成5種菌落形態(tài)(VS、VM、VH-I、VH-II和VH-III)，其中形成VH-II菌落的比例較高。圖2,圖3

注：VS型：菌絲型菌落；VM型：中間型菌落；VH-I型：菌核-I型菌落；VH-II型：菌核-II型菌落；VH-III型：菌核-III型菌落

Note: VS type: hyphal type colony; VM type: intermediate type colony; VH-I type: sclerotium-I type colony; VH-II type: sclerotium-II type colony; VH-III type: sclerotium-III type colony

圖2 棉花黃萎病菌18個(gè)代表菌株培養(yǎng)性狀
Fig.2 Culture characteristics of 18 representative strains ofV.dahliae

圖3 棉花黃萎病菌18個(gè)代表菌株菌落直徑
Fig.3 Colony diameter of 18 representative strains ofV.dahlia

2.4 棉花黃萎病菌對(duì)棉花苗期的致病力測(cè)定

將18個(gè)代表菌株接種第3片真葉展開(kāi)時(shí)的陸地棉感病品種軍棉1號(hào)，接種10 d時(shí)植株陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)黃萎病典型癥狀，隨著病情擴(kuò)展，菌株之間的致病性表現(xiàn)明顯差異：同一地區(qū)的不同菌株致病力表現(xiàn)差異，如來(lái)自石河子121團(tuán)26連的SD-1菌株的致病力最強(qiáng)，接種30 d導(dǎo)致所有病株死亡，病指達(dá)到100，而來(lái)自石河子121團(tuán)11連的SD-7菌株的致病力最弱，病指為34.03；此外，博樂(lè)的2個(gè)菌株之間、五家渠的3個(gè)菌株之間及奎屯的4個(gè)菌株之間的致病力均存在明顯差異，北疆棉田黃萎病菌存在致病力分化。不同致病類型菌株之間致病力也存在差異，5個(gè)非落葉型菌株中，BND-1菌株引起的病指達(dá)到90.28，其它4個(gè)菌株引起的病指較低，在34.04～52.78，非落葉菌株之間致病力存在分化；13個(gè)落葉型菌株中，除了2個(gè)菌株(WD-3和SD-7)引起的病指低于40外，其它11個(gè)菌株引起的病指均高于54，其中3個(gè)菌株的病指高于90，4個(gè)菌株的病指高于80，其它4個(gè)菌株的病指范圍在54.17～70.83，說(shuō)明落葉型菌株的致病力也存在分化；大多數(shù)落葉型菌株引起的病指高于非落葉型菌株引起的病指，說(shuō)明落葉型菌株的致病力普遍高于非落葉型菌株的致病力。

將菌株的致病力與其菌落類型進(jìn)行對(duì)應(yīng)，結(jié)果顯示，產(chǎn)生中間型菌落(VM)的2個(gè)菌株(WD-3和SD-7)的致病力最弱；病指分別為39.58和34.03，產(chǎn)生菌絲型(VS)的2個(gè)菌株(BD-2和KD-4)的致病力中等，病指分別為54.17和70.83；產(chǎn)生菌核型菌落的菌株，其致病力存在明顯差異，如產(chǎn)生VH-I型菌落的菌株，BND-1的病指是90.28，WND-1的病指是52.78，KND-2的病指是34.68，至少菌核型菌株的致病力與其菌落形態(tài)之間沒(méi)有相關(guān)性。表5

3 討 論

研究從北疆棉田病株上分離到644個(gè)大麗輪枝菌菌株，67.5%的菌株為落葉型菌系，27.8%為非落葉型菌系，供試菌株中以落葉型菌系為主要致病類型。還有4.7%的菌株不能用落葉型和非落葉型對(duì)其致病類型進(jìn)行歸類，該劃分標(biāo)準(zhǔn)存在局限。由于番茄大麗輪枝菌根據(jù)是否介導(dǎo)含Ve1基因的番茄產(chǎn)生抗性分為1號(hào)生理小種(含Ave1基因)和2號(hào)生理小種(含Ave1基因)[8]，對(duì)130個(gè)棉花大麗輪枝菌菌株進(jìn)行生理小種鑒定，所有菌株均為2號(hào)生理小種，棉花黃萎病菌不含Ave1基因，生理小種的劃分標(biāo)準(zhǔn)不適合棉花大麗輪枝菌，這與劉琳琳[16]和喻秀秀等[17]的研究結(jié)果一致。

表5 棉花黃萎病菌18個(gè)代表菌株培養(yǎng)性狀及致病力的鑒定
Table 5 Culture characteristics and pathogenicity of 18V.dahliaestrains

序號(hào)NO.編號(hào)Number采集地點(diǎn)Location經(jīng)度/ELongitude緯度/NLatitude菌落類型Coloytype 致病類型Pathotypes病情指數(shù)Diseaseindex1YD-1伊犁64團(tuán)11連80°69'23″43°96'63″VH-IID96.532BND-1博樂(lè)83團(tuán)6連82°57'44″44°53'35″VH-IND90.283BD-2博樂(lè)89團(tuán)4連82°40'23″44°79'12″VSD54.174WND-1五家渠新湖農(nóng)場(chǎng)87°54'01″44°16'79″VH-IND52.785WD-2五家渠芳草湖87°54'79″44°16'09″VH-ID81.256WD-3五家渠105團(tuán)14連86°80'94″44°40'32″VMD39.587KND-1奎屯127團(tuán)1連84°25'21″44°1'56″VH-IND44.448KD-4奎屯127團(tuán)27連85°35'15″44°38'15″VSD70.839KD-3奎屯128團(tuán)1連84°38'25″45°3'57″VH-IIID59.0310KND-2奎屯130團(tuán)9連84°47'10″44°46'47″VH-IND34.6811SD-1石河子121團(tuán)26連85°33'5″44°38'45″VH-IID10012SD-2石河子133團(tuán)9連85°19'53″44°39'56″VH-IID93.7513SD-3石河子150團(tuán)8連86°07'42″44°55'27″VH-IID66.6714SD-4石河子144團(tuán)9連85°37'48″44°31'16″VH-IID87.5015SD-5石河子147團(tuán)7連86°06'12″44°33'46″VH-IID84.7216SND-6石河子148團(tuán)13連86°01'59″44°33'44″VH-IIIND34.0417SD-7石河子121團(tuán)11連85°39'10″44°48'5″VMD34.0318TD-1塔城184團(tuán)8連86°35'57″46°27'90″VH-ID81.94

韓宏偉等[5]對(duì)2008年北疆發(fā)生的41個(gè)棉花黃萎病菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示落葉型菌株占供試菌株的39%，劉海洋等[7]對(duì)2013年南、北疆發(fā)生的59個(gè)棉花黃萎病菌進(jìn)行鑒定，落葉型菌株占供試菌株的37.2%，劉廷利等[18]對(duì)2014年北疆發(fā)生的17個(gè)棉花黃萎病菌進(jìn)行鑒定，落葉型菌株占供試菌株的76.5%。研究對(duì)田間病株的鑒定結(jié)果顯示落葉型菌株占供試菌株的67.5%，并且對(duì)發(fā)病地塊進(jìn)行分析，單一落葉型菌株發(fā)生的地塊最多，其次是落葉型和非落葉型菌株混合發(fā)生地塊，田間以落葉型菌株為優(yōu)勢(shì)菌株的地塊占總地塊數(shù)的70.1%；表明落葉型菌株在棉田的分布在不斷增加，已是田間地塊的主要致病類型。但是通過(guò)對(duì)奎屯地區(qū)40塊條田178個(gè)菌株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)奎屯棉花黃萎病菌以非落葉型大麗輪枝菌為優(yōu)勢(shì)菌系，并且非落葉型菌株為優(yōu)勢(shì)菌系的地塊占67.5%，奎屯地區(qū)棉花黃萎病菌的致病類型不同于北疆其它地區(qū)，是否與當(dāng)?shù)氐姆N植的品種及種子來(lái)源有關(guān)有待進(jìn)一步研究。另外，由于研究病株采集區(qū)域有限及條田病株數(shù)較少，因此,對(duì)于整個(gè)北疆棉區(qū)棉花黃萎病菌的致病類型及落葉型和非落葉型菌系的田間分布還需要更大范圍的病株采集、分離與鑒定。

朱荷琴等[4]對(duì)全國(guó)不同地區(qū)來(lái)源的大麗輪枝菌的培養(yǎng)性狀進(jìn)行分析，認(rèn)為新疆棉區(qū)的大麗輪枝菌的培養(yǎng)性狀變異最小。而研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自北疆棉區(qū)的18個(gè)代表菌株，2個(gè)菌株形成菌絲型菌落，2個(gè)菌株形成中間型菌落，14個(gè)菌株形成菌核型菌落；菌核型菌株又進(jìn)一步分化形成3種不同的菌落形態(tài)，并且菌株間的菌落生長(zhǎng)速度也存在差異，表明北疆棉花黃萎病菌的培養(yǎng)性狀存在明顯分化。袁洪波等[19]2013年的研究發(fā)現(xiàn)，石河子棉花黃萎病菌以菌絲型菌株最多，占60%；其次是菌核型，占26.7%。研究表明，北疆棉花黃萎病菌以菌核型菌株最多，占77.8%，是主要的培養(yǎng)類型；18個(gè)代表菌株中來(lái)自石河子的7個(gè)菌株，6個(gè)產(chǎn)生菌核型菌落，1個(gè)產(chǎn)生中間型菌落，并且從石河子地區(qū)40個(gè)條田的病株上分離了178個(gè)菌株，菌核型菌株的比例占78.05%，中間型占19.02%，菌絲型占2.93%，與袁洪波等[19]的結(jié)果不一致。另外，將供試菌株的菌落類型與其致病類型進(jìn)行對(duì)應(yīng)，發(fā)現(xiàn)非落葉型菌株形成VH-I型菌落的比例較高，落葉型菌株雖然可形成5種菌落形態(tài)(VS、VM、VH-I、VH-II和VH-III)，但是形成VH-II菌落的比例較高，因此,菌落類型與其致病類型之間是否有一定的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

在感病棉花品種軍棉1號(hào)上，大麗輪枝菌的致病性存在明顯分化：一是同一地區(qū)的不同菌株，其致病力存在明顯差異，因此,在同一地區(qū)推廣某一個(gè)耐病品種很難達(dá)到有效防治棉花黃萎病的目的；二是不同致病類型的菌株之間致病力存在差異，落葉型菌株的致病力普遍高于非落葉型菌株的致病力，而且相同致病類型的菌株之間的致病力也存在差異，如非落葉型菌株中也有致病力很強(qiáng)的菌株。新疆棉花黃萎病菌致病類型從2004年報(bào)道以非落葉型、中等致病力菌株為主到目前以落葉型菌株為主[20]，致病類型迅速變異及致病性明顯變強(qiáng)的原因普遍認(rèn)為是與新疆大量從內(nèi)地引種有關(guān)，但是非落葉型菌株中出現(xiàn)致病力更強(qiáng)的菌株可能是大麗輪枝菌與不同抗性寄主互作、協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。將菌株的致病力與培養(yǎng)性狀進(jìn)行對(duì)應(yīng)，產(chǎn)生中間型菌落的2個(gè)菌株的致病力最弱；產(chǎn)生菌絲型菌落的2個(gè)菌株致病力中等，產(chǎn)生菌核型菌落的菌株，其致病力存在明顯差異。宋曉軒等[21]報(bào)道棉花黃萎病菌產(chǎn)生菌絲型菌落的菌株致病力普遍比菌核型菌株的高，田秀明[22]報(bào)道的棉花黃萎病菌產(chǎn)生菌絲型菌落的菌株致病力相對(duì)較弱，大麗輪枝菌的培養(yǎng)特性與其致病力之間沒(méi)有相關(guān)性。

4 結(jié)論

從北疆棉田病株上分離到644個(gè)大麗輪枝菌菌株，67.6%的菌株為落葉型菌系，27.8%菌株為非落葉型菌系，4.7%菌株不能歸類，供試菌株的致病類型存在分化；分析菌株在條田中的分布，以落葉型菌株為優(yōu)勢(shì)菌株的地塊占70%，落葉型菌系為田間主要致病類型。18個(gè)代表菌株的培養(yǎng)特性存在菌核型、菌絲型和中間型3種菌落類型，菌核型為主要培養(yǎng)類型，并進(jìn)一步分化成3種不同類型。落葉型菌株的致病力普遍高于非落葉型菌株，非落葉型菌株中也有致病力很強(qiáng)的菌株；同一地區(qū)的不同菌株的致病力存在明顯差異。田間棉花黃萎病菌的致病類型、培養(yǎng)特性及致病力均存在明顯分化。