四種菊科蒿屬植物精油殺螨活性及茵陳蒿揮發(fā)油成分分析

趙娜娜，路 偉，傅文佳，古麗米熱·艾買(mǎi)提，杜書(shū)亞

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊，830052)

0 引 言

【研究意義】2017 年新疆棉花播種面積 228.11 ×104hm2，其種植面積約占全國(guó)種植面積的 70% 以上[1]。影響新疆棉花生產(chǎn)的棉花害蟲(chóng)多達(dá)50多種，是導(dǎo)致棉花產(chǎn)量損失的主要原因之一，其中，自20世紀(jì)90年代至今，蚜蟲(chóng)、棉葉螨、棉鈴蟲(chóng)仍然是影響新疆棉花生產(chǎn)的三大害蟲(chóng)，未得到有效的控制。土耳其斯坦葉螨是北疆棉花害螨優(yōu)勢(shì)種群[2,3]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在新疆100×104hm2棉花中, 每年受棉葉螨為害的達(dá)53.33×104hm2，絕收1.33×104hm2，棉葉螨使棉花減產(chǎn)達(dá)10%～68%，給棉花生產(chǎn)帶來(lái)很大的影響[4, 5]。土耳其斯坦葉螨T.turkestani屬真螨目Acariformes、葉螨科Tetranychidae、葉螨屬Tetranychus，主要分布于俄羅斯、哈薩克斯坦、美國(guó)、中東和中國(guó)等地，在中國(guó)僅分布于新疆地區(qū)，其他地區(qū)還未見(jiàn)報(bào)道[6-9]。【前人研究進(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外防治土耳其斯坦葉螨的主要手段依然是化學(xué)防治，主要以有機(jī)磷類(lèi)、新型抗生素類(lèi)和菊酯類(lèi)農(nóng)藥殺螨劑對(duì)土耳其斯坦葉螨進(jìn)行防治，土耳其斯坦葉螨繁殖速率快、世代周期短，短期內(nèi)對(duì)一些常用殺蟲(chóng)劑可以產(chǎn)生強(qiáng)抗性，也成為制約新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵因子[10]。篩選出高效、低毒、對(duì)環(huán)境友好的新型生物農(nóng)藥，研究生物殺螨劑對(duì)棉葉螨的防治效果和毒力，不僅對(duì)棉田殺螨劑的合理使用具有指導(dǎo)意義，還對(duì)于園藝植物替代藥劑，綠色產(chǎn)品、無(wú)公害產(chǎn)品害螨防治具有參考價(jià)值[11]。【本研究切入點(diǎn)】植物源農(nóng)藥是一類(lèi)來(lái)源于植物體的農(nóng)藥，其有效成分通常不是單一化合物。因其對(duì)環(huán)境友好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、作用方式特異、促進(jìn)作物生長(zhǎng)并提高抗病性、種類(lèi)多、開(kāi)發(fā)途徑多等特點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注[12]。目前，在我國(guó)研究比較深入的殺蟲(chóng)植物中，具有代表性的就屬菊科植物，其中蒿屬植物更是其中的佼佼者之一。蒿屬(Artemisia)是菊科(Compositae)黃春菊族(Anthemideae)的一個(gè)大屬，該屬在世界分布約300多種，其中黃花蒿、野艾蒿、毛蓮蒿、豬毛蒿、茵陳蒿、大籽蒿、一枝蒿等具有殺蟲(chóng)、殺菌的活性，有開(kāi)發(fā)為天然產(chǎn)物的潛力。研究4種蒿屬植物黃花蒿、茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的生物活性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取植物精油，葉片浸漬法測(cè)定上述4種植物精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的毒力，評(píng)價(jià)不同精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的觸殺活性，為植物源殺螨劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

萎蒿、茵陳蒿、黃花蒿分別采集自江蘇、陜西、河南，一枝蒿采自新疆維吾爾自治區(qū)。所有植物標(biāo)本保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲(chóng)系天然產(chǎn)物與化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.1 植物

蔞蒿、茵陳蒿、黃花蒿分別采集自江蘇、陜西、河南，一枝蒿采自新疆維吾爾自治區(qū)。所有植物標(biāo)本保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲(chóng)系天然產(chǎn)物與化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。表1。

表1 4種植物名錄
Table1 Four plants directory

種類(lèi)Species拉丁名scientific name科名Family采集部位Source黃花蒿Artemisia annua Linn.菊科全草蔞蒿Artemisia selengensis Turcz.ex Bess菊科全草一枝蒿Artemisia rupestris L.菊科根莖茵陳蒿Artemisia capillaries Thunb.菊科全草

1.1.2 土耳其斯坦葉螨

供試蟲(chóng)源：土耳其斯坦葉螨于2017年6月采自新疆沙灣縣棉花田的自然種群，采集前棉田未施用任何藥劑。將采集的棉葉螨接到室內(nèi)種植的盆栽棉花上，等飼養(yǎng)至下一代后再挑選同一批次羽化的成蟲(chóng)，挑選大小一致的成螨作為試蟲(chóng)，試蟲(chóng)不分雌雄。

飼養(yǎng)條件：接種后的盆栽棉花置于人工氣候箱內(nèi)，氣候箱設(shè)置溫度(26～28)℃，相對(duì)濕度為75%，光照黑暗時(shí)間為14 h∶8 h(L∶D)。

1.1.3 試劑與儀器

儀器：連續(xù)蒸餾裝置，北京玻璃儀器廠；DZTW型調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52CS型號(hào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； FA2004N電子天平，天津天馬衡基有限公司；PSX-280H恒溫恒濕箱，寧波萊?？萍加邢薰?。

化學(xué)試劑：正己烷、丙酮、無(wú)水硫酸鈉(分析純)均購(gòu)自天津化學(xué)試劑公司；聚四氟乙烯購(gòu)于上海三愛(ài)富公司。

1.2 方 法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取植物精油

通過(guò)水蒸汽蒸餾法提取黃花蒿、茵陳蒿、蔞蒿、一枝蒿精油，提取方法如下：取0.5 kg植物一次全部放入到3 000 mL的圓底燒瓶，加2 000 mL水，用水蒸氣蒸餾法蒸餾3～4 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用無(wú)水硫酸鈉脫水后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)濃縮(40℃)回收正己烷，所得殘留的油狀液即為精油，測(cè)比重，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 觸殺活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)配制濃度為2%的瓊脂，將加熱后的瓊脂倒入12孔的培養(yǎng)板內(nèi)，瓊脂高度約為0.5 cm，置于-4℃冰箱內(nèi)備用。將田間采集未施藥劑的新鮮棉花葉片洗凈晾干，用直徑為2 cm的打孔器打孔待備用；以丙酮為溶劑配制2 mL濃度為50%、10%、2%、0.4%的藥劑，棉花葉片在溶液中浸泡10 s后，用鑷子夾出，置于濾紙上自然揮發(fā)2 min，然后葉背朝上置于已倒好的瓊脂上，挑取10頭健康一致的成蟲(chóng)于葉片上，宣紙蓋在培養(yǎng)板上，固體膠封好，置于溫度為25 °C、濕度為70%的溫箱內(nèi)。24 h后，觀察和記錄試蟲(chóng)的死亡情況。每個(gè)濃度重復(fù)5次，每個(gè)重復(fù)10頭試蟲(chóng)，丙酮不加藥劑作空白對(duì)照。用毛筆撥動(dòng)蟲(chóng)體，蟲(chóng)體不動(dòng)即為死亡。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在死亡率為0～100%的濃度范圍內(nèi)選取6個(gè)濃度，方法同預(yù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)5次。

死亡率(%)=100×死蟲(chóng)數(shù)/試蟲(chóng)數(shù)。

校正死亡率(%)=100×[處理組死亡率-對(duì)照組死亡率/(1-對(duì)照組死亡率)]。

半致死濃度(LC50)即引起50%土耳其斯坦葉螨死亡率的濃度，使用Probit軟件包計(jì)算得到半致死濃度。

1.2.3 GC-MS測(cè)定精油化學(xué)成分

樣品送至北京師范大學(xué)分析測(cè)試中心。

采用美國(guó)Bruker公司450 GC-320 MS三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，配備BP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI離子源溫度210℃；傳輸線溫度250℃；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量1驗(yàn)μL，分流比1∶10。升溫程序：起始溫度50℃，停留5 min，之后以10℃/min的速率升溫至290℃，停留15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物活性

研究表明，在藥劑濃度為60.00 mg/mL時(shí)，蔞蒿、茵陳蒿、一枝蒿精油的致死率均高達(dá)100.00%，黃花蒿的致死率分別為52.00%，活性相對(duì)較弱；在濃度為40 mg/mL時(shí)，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油的致死率高達(dá)90.00%、90.00%、84.00%，黃花蒿的活性較弱，致死率為24.00%；在濃度為26.70 mg/mL時(shí)，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿的致死率分別高達(dá)86.00%、80.00%和68.00%，黃花蒿的致死率依然最低為20.00%；在濃度為18.30 mg/mL時(shí)，茵陳蒿、一枝蒿精油的致死率分別為48.00%、46.00%，蔞蒿的致死率分別為26.00%黃花蒿的活性較弱，致死率僅為4.00%；在濃度為11.70 mg/mL時(shí)，活性較好的茵陳蒿、蔞蒿，致死率分別為18.00%、16%，黃花蒿無(wú)活性；在濃度為8.00 mg/mL時(shí)，僅有茵陳蒿、一枝蒿有較弱活性，致死率分別為20.00%、16.00%。表2

表2 4種精油處理土耳其斯坦葉螨24 h后校正死亡率
Table 2 Correct mortalityof the four essential oils againstT.turkestaniadults after 24 h(%).

藥劑Species60.00 mg/mL40.00 mg/mL26.70 mg/mL18.30 mg/mL11.70 mg/mL8.00mg/mL黃花蒿52.00±4.90b24.00±2.45d20.00±0.00c4.00±2.45c0.00c0.00c一枝蒿100.00a90.00±3.16a80.00±3.16a46.00±5.10a14.00±4.00ab16.00±4.00ab茵陳蒿100.00a90.00±3.16ab86.00±4.00a48.00±3.74a18.00±3.74a20.00±0.00a蔞蒿100.00a84.00±2.45bc68.00±3.74b26.00±2.45b16.00±6.00a8.00±4.89bc

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小字母表示0.05水平上差異顯著

Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

研究表明，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的觸殺活性較好，LC50分別為17.49、18.17、22.26 mg/mL，與陽(yáng)性對(duì)照除蟲(chóng)菊提取物觸殺活性(LC50=4.12 mg/mL)相比相差在10倍以?xún)?nèi)；黃花蒿精油的觸殺活性最弱，LC50為54.00 mg/mL，是陽(yáng)性對(duì)照除蟲(chóng)菊提取物的13.11倍。表3

表3 4種精油對(duì)土耳其斯坦葉螨觸殺活性
Table 3 Contact toxicity of the 4 essential oils againstT.turkestaniadults.

藥劑SpeciesLC50 (mg/mL)95% 置信區(qū)間 (mg/mL)95% Confidence intervals (mg/mL)Slope±SE黃花蒿54.0048.20-61.593.703±0.401蔞蒿22.2618.93-27.083.255±0.348茵陳蒿17.4914.17-20.044.232±1.025一枝蒿18.1716.04-20.483.700±0.357除蟲(chóng)菊提取物4.122.70-6.530.823±0.149

2.2 茵陳蒿精油的化學(xué)成分

茵陳蒿精油通過(guò)GC-MS檢測(cè)并鑒定出33個(gè)峰，其中出峰時(shí)間在17.46 min時(shí)的物質(zhì)含量最高。研究表明，茵陳蒿精油化學(xué)成分及相對(duì)含量大根香葉烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、a-畢橙茄醇(7.03%)、依蘭油醇(4.83%)等。圖1，表4

圖1 茵陳蒿精油離子譜
Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from A.capillaries

3 討 論

菊科植物中有多數(shù)高活性植物，其中蒿屬植物更是其中的佼佼者之一，如Tonk等[13](2006)分別提取了黃花蒿的石油醚部分和正己烷部分，并測(cè)定黃花蒿提取物對(duì)斯氏按蚊3齡幼蟲(chóng)的生物活性，結(jié)果表明，黃花蒿提取物的效果較好。韓小冰等[14](2011)對(duì)大籽蒿、黃花蒿、豬毛蒿對(duì)舞毒蛾具有較強(qiáng)的觸殺作用。王宇新[15](2009)測(cè)定了黃花蒿精油和豬毛蒿精油對(duì)玉米象成蟲(chóng)的生物活性，結(jié)果表明，在觸殺活性測(cè)定中，0.5 μL/頭處理24 h后，黃花蒿精油和豬毛蒿精油對(duì)試蟲(chóng)的校正死亡率分比為96.66%、97.77%，表現(xiàn)了較高的觸殺活性；在熏蒸活性測(cè)定中，兩種精油表現(xiàn)了較高的熏蒸活性，83.33 μL/L處理48 h后，試蟲(chóng)的校正死亡率均為65%以上；在驅(qū)避活性測(cè)定中，兩種精油對(duì)玉米象成蟲(chóng)均有良好的驅(qū)避作用，8 μL處理24 h后，趨避活性為Ⅳ級(jí)。袁海濱等[16](2007)測(cè)定了豬毛蒿、黃花蒿、水蒿、大籽蒿4種植物精油對(duì)綠豆象成蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性，結(jié)果表明，這4種植物精油均對(duì)綠豆象有較好的熏蒸劑觸殺活性。謝怡孫等[17](2001)測(cè)定了蔞蒿精油對(duì)菜青蟲(chóng)具有較強(qiáng)的拒食和胃毒作用。Liu等[18]測(cè)定了一枝蒿精油對(duì)嗜卷書(shū)虱的趨避活性、觸殺活性和熏蒸活性，并以生物測(cè)定為指導(dǎo)分離純化出松油醇、乙酸松油脂、4-松油醇和芳樟醇4種活性化合物。茵陳蒿、蔞蒿、黃花蒿、一枝蒿4種蒿屬植物多集中在殺蟲(chóng)活性方面，還未有文獻(xiàn)報(bào)道其殺螨活性。

表4 茵陳蒿精油的化學(xué)成分
Table 4 The chemical constituents of the essential oil derived fromA.capillaries(≥1.00%)

序號(hào)Number保留時(shí)間(RT)Retention Time化合物Compounds相對(duì)含量(%)Peak area (%)19.26β-蒎烯 (.beta.-Pinene)1.00310.68羅勒烯(1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-)1.00411.67芳樟醇(1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-)1.30616.67石竹烯(Caryophyllene)8.70716.96(E)-β-金合歡烯( 1,6,10-Dodecatriene, 7,11-dimethyl-3-methylene-, (E)-)1.34817.14α-石竹烯(.alpha.-Caryophyllene)1.19917.34可巴烯(Copaene)3.681017.382-甲基-6-對(duì)甲苯基-2-2-庚烯醇(6-(p-Tolyl)-2-methyl-2-heptenol)1.261117.46大根香葉烯 D(1,6-Cyclodecadiene, 1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-, [s-(E,E)]-)16.161217.61聯(lián)二苯(Biphenyl)3.181317.641,1-二甲基-二丁基-2,2,3,3-四氟丙基磷酸酯(Phosphoric acid, dibutyl 1,1-dim-ethyl-2,2,3,3-tetrafluoropropyl ester)4.431518.33氧化石竹烯(Caryophyllene oxide)10.421618.65桉油烯醇((-)-Spathulenol)3.301719.41依蘭油醇(tau.-Muurolol)4.831819.55a-畢橙茄醇(.alpha.-Cadinol)7.032019.78環(huán)氧異香樹(shù)烯(Isoaromadendrene epoxide)1.592220.842-甲基-4-(2,6,6-三甲基環(huán)己烯基)2-丁烯-1-醇(2-Methyl-4-(2,6,6-tri-methylcyclohex-1-enyl)but-2-en-1-ol)1.04總含量74.52

根據(jù)研究結(jié)果表明：茵陳蒿和一枝蒿精油對(duì)土耳其斯坦葉螨具有較好的觸殺活性，其LC50值分別為17.49、18.17 mg/mL，活性雖弱于陽(yáng)性對(duì)照，但與陽(yáng)性對(duì)照除蟲(chóng)菊提取物(LC50=4.12 mg/mL)相比，活性相差在10倍以?xún)?nèi)，表明茵陳蒿和一枝蒿具有較好的殺螨活性。且有文獻(xiàn)表明茵陳蒿對(duì)玉米象有熏蒸活性，其LC50分別是5.31和7.35 mg/L，同時(shí)也表現(xiàn)出觸殺活性，其LD50分別是105.95和87.92 μg/頭[19]。表明茵陳蒿精油具有較好的殺螨活性和殺蟲(chóng)活性，具有發(fā)展為天然農(nóng)藥的潛力。

茵陳蒿A.capillaries為菊科、蒿屬植物，有特異的香氣，味微苦，主產(chǎn)江西、江蘇、安徽、湖北、浙江、陜西、河北、山東等省；為治肝、膽疾患的主要成分，水提取液對(duì)多種桿菌、球菌有抑制作用，揮發(fā)油有抗霉菌的作用[20]。研究測(cè)得茵陳蒿精油的主要化學(xué)成分為大根香葉烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)和石竹烯(8.70%)a-畢橙茄醇(7.03%)/依蘭油醇(4.83%)。這幾種主要成分有可能是關(guān)鍵的殺螨活性成分，但還有待進(jìn)一步分離純化，驗(yàn)證生物活性。關(guān)鍵的化學(xué)成分則可以殺螨劑的合成提供先導(dǎo)化合物，為植物源農(nóng)藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于植物源藥劑防治棉葉螨的研究較多，大都集中在朱砂葉螨、二斑葉螨的生物活性研究方面，僅有一篇外文文獻(xiàn)報(bào)道了迷迭香、薄荷等精油及其主要化學(xué)成分對(duì)土耳其斯坦葉螨的熏蒸活性[21]。有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)植物資源，為土耳其斯坦葉螨的生物防除提供理論依據(jù)，為植物源殺螨劑的研制提供技術(shù)數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

4種參試菊科蒿屬植物中，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油對(duì)土耳其斯坦葉螨具有較好的觸殺活性，其中茵陳蒿的活性最好，稍弱于除蟲(chóng)菊提取物，有發(fā)展為天然殺螨劑的潛力。茵陳蒿精油通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，主要成分為大根香葉烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、a-畢橙茄醇(7.03%)、依蘭油醇(4.83%)。