微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株不同保藏方法的比較

林嘉欣，安 東，劉 瑩，孫雪蓮，孫小紅

（大連出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心莊河分中心，遼寧大連 116400）

標(biāo)準(zhǔn)菌株是實驗室不可缺少的一部分，一般由美國模式培養(yǎng)物集存庫、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心等菌株保藏機(jī)構(gòu)提供，其遺傳特性得到了確認(rèn)、保證和可追溯性。實驗室常將標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)用于檢測方法比較、培養(yǎng)基技術(shù)驗收、檢測陽性對照、人員技術(shù)比對、儀器設(shè)備性能的監(jiān)控[1]等，是微生物檢測質(zhì)量控制的重要手段之一[2]。而菌株保藏是一切微生物工作的基礎(chǔ)，其目的是使菌株被保藏后減少死亡、變異、被雜菌污染，并保持其良好的活性[3]。因此，實驗室在選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株的保藏方法時至關(guān)重要。至今，現(xiàn)有的菌株保藏方法幾十種，筆者只選擇其中3種方法進(jìn)行比較，從操作、保藏時間、占用空間和菌株存活情況4個方面進(jìn)行分析，從而比較出3種保藏方法中保藏效果最優(yōu)的方法。

1 菌株保藏的原理

為了能夠長期保持標(biāo)準(zhǔn)菌株的良好活性，如何降低因微生物旺盛生長、繁殖而引起的標(biāo)準(zhǔn)菌株變異率就成為核心問題，因此必須創(chuàng)造一種良好的環(huán)境，能夠降低微生物的新陳代謝，使微生物生長繁殖遲緩。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株來源

實驗室標(biāo)準(zhǔn)菌株來源，美國模式培養(yǎng)物集存庫、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

2.1.2 試劑、培養(yǎng)基及器材

半固體瓊脂、無菌液體石蠟，均購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供；新鮮牛奶；菌株保藏管。

2.2 方法

2.2.1 半固體瓊脂石蠟保存法

配制好半固體瓊脂培養(yǎng)基，分裝試管，于121℃下高壓滅菌15 min，垂直放置凝固后備用。

用接種針挑取復(fù)活后的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落垂直穿刺于半固體瓊脂培養(yǎng)基中，接種針距離試管底部1/3處即可，多次穿刺。接種完的半固體瓊脂菌株管放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，在無菌的環(huán)境下，取適量滅菌的液體石蠟滴加于半固體瓊脂菌株管表面，放于4℃冰箱中保藏，一年需要進(jìn)行轉(zhuǎn)種鑒定1次。

2.2.2 細(xì)菌濕種牛奶凍存法

將新鮮牛奶煮沸，冷卻后脫去上層脂肪層，分裝小試管，每管1 mL，滅菌后備用。將標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線接種于平板，分離培養(yǎng)后，用接種環(huán)刮取2～3環(huán)菌落接種于牛奶中充分混勻，放于-20℃冰箱中保存。使用時，取出菌株管放于室溫下溶解，待部分溶解時即可取出1環(huán)劃線接種于平板，并將菌株管再迅速凍存，每個菌株管可反復(fù)使用3～5次[4]。此法一般菌株可存活5年左右。

2.2.3 菌株保藏管法

菌株保藏管法是通過利用成品化的菌株保藏管對需要保藏的菌株進(jìn)行保藏，它是一種用于菌株保藏或轉(zhuǎn)移的容器[5]。挑取復(fù)活后的菌株制成菌懸液，接種到菌株保藏管中混勻，使菌株吸附在每個磁珠上，然后用無菌吸管將保藏管中多余的液體吸出，在保藏管壁上標(biāo)記菌株的信息及接種時間，將菌株保藏管置于-70℃的超低溫冰箱中保藏，可保存10年。菌株復(fù)蘇時，只要取出菌株保藏管，不要解凍，用接種針或鑷子取出磁珠劃線接種于固體培養(yǎng)基或直接置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌株保藏管使用后要盡快放回超低溫冰箱中保藏。

3 結(jié)果與分析

不同種標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏方法存在的利弊不同，因此對每種保藏方法從操作、保藏時間、占用空間和菌株存活情況進(jìn)行具體分析和比較。

3.1 半固體瓊脂石蠟保存法

（1）該方法前期準(zhǔn)備工作比較繁瑣，需要進(jìn)行培養(yǎng)基的配制，而且菌株保藏過程中需要定期加入無菌液體石蠟。

（2） 該方法每年需要轉(zhuǎn)種1次，而《中國藥典》（2015年版）明確規(guī)定“菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌株保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代）”[6]，因此該方法保藏菌株時間較短。

（3）需要垂直保藏，占用空間較大。

（4）菌株不易發(fā)生污染、變異等問題。

3.2 細(xì)菌濕種牛奶凍存法

（1）該方法前期準(zhǔn)備工作相對繁瑣。

（2）保藏時間較長。

（3）試管體積偏大，占用菌株保藏空間較大。

（4）使用時需要室溫溶解，可能會出現(xiàn)培養(yǎng)基變質(zhì)等問題，并且反復(fù)使用容易造成菌株污染、變異、活性降低等。

3.3 菌株保藏管法

（1）該方法操作簡單，減少了菌株保藏的前期準(zhǔn)備工作。

（2）菌株保藏時間長，減少了定期轉(zhuǎn)種的麻煩。

（3）保藏管體積較小，能夠節(jié)省保藏空間。

（4）該方法不會發(fā)生因培養(yǎng)基變質(zhì)而使菌株發(fā)生變異、污染、活性降低等問題。

對3種不同標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏方法進(jìn)行比較。3種不同保藏方法的比較見表1。

表1 3種不同保藏方法的比較

4 結(jié)論

闡述了3種不同的菌株保藏方法，從操作、保藏時間、占用空間和菌株存活情況4個方面進(jìn)行比較：從操作方面看，半固體瓊脂石蠟保存法和細(xì)菌濕種牛奶凍存法的前期準(zhǔn)備工作相對繁瑣，而菌株保藏管法減少了這方面的麻煩，從而減少了人力的輸出；從保藏時間方面，半固體瓊脂石蠟保存法保藏時間短，需要定期轉(zhuǎn)種，菌株管理比較麻煩，而細(xì)菌濕種牛奶凍存法和菌株保藏管法保藏時間較長；從占用空間方面，半固體瓊脂石蠟保存法和細(xì)菌濕種牛奶凍存法都是用試管來保藏菌株，占用很大空間，菌株保藏管體積小，節(jié)省保藏空間；從菌株存活情況方面，細(xì)菌濕種牛奶凍存法可能因轉(zhuǎn)種過程中培養(yǎng)基變質(zhì)導(dǎo)致菌株發(fā)生變異、污染、活性降低等問題。綜上可以看出，菌株保藏管法要優(yōu)于另外2種方法。