響應(yīng)面法優(yōu)化牡蠣多肽酶解工藝的研究

陳弘培 ，劉藝琳 ，龔世禹 ， 劉 斌 ，3， 曾 峰

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究中心，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002）

隨著社會(huì)的發(fā)展，海洋中蘊(yùn)藏的對(duì)人類(lèi)健康有益的生物活性物質(zhì)或功能性成分逐漸受到研究者的關(guān)注。海洋生物已成為發(fā)現(xiàn)新型生物活性成分和研究功能性食品的重要來(lái)源。牡蠣又稱(chēng)為生蠔，屬于軟體動(dòng)物門(mén)、瓣鰓綱、異柱目、牡蠣科，是世界第一大養(yǎng)殖貝類(lèi)，也是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類(lèi)之一。牡蠣是一種高營(yíng)養(yǎng)的海洋動(dòng)物[1]，同時(shí)也是藥食同源的保健品[2]。牡蠣（Oyster），被譽(yù)為“海洋里的牛奶”，富含蛋白質(zhì)和對(duì)人體重要的鋅元素。牡蠣體內(nèi)含糖原[3]，10種人體必需的氨基酸，?；撬岷坑绕湄S富[4]。牡蠣中含有 Cu，Zn，Mn，Ba，P，Ca等無(wú)機(jī)物，研究發(fā)現(xiàn)牡蠣具有抗腫瘤、降血壓、護(hù)肝、抗氧化、抗疲勞、抗病毒、抑菌等功能。

當(dāng)今世界對(duì)食品多肽的研究日益重視，不僅因其具有較高安全性，相對(duì)于蛋白質(zhì)，多肽更易被人體吸收利用。此外大多數(shù)多肽具有抗氧化等功能。因此，在功能保健食品方面將具有發(fā)展前景。郭溆等人[5]利用黃秋葵籽粕蛋白，采用酶解法獲得具有抗氧化活性的多肽。徐浩等人[6]制備了河蜆酶解液，發(fā)現(xiàn)分子量小于5 kDa的抗氧化活性最高。蘆鑫等人[7]發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解芝麻蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化的水平。試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)牡蠣多肽的酶解工藝進(jìn)行了研究，以提高牡蠣多肽的利用，為牡蠣的綜合利用提供了新思路。

1 材料與儀器

1.1 原料

牡蠣（Oyster），購(gòu)于福州市金山大潤(rùn)發(fā)超市，敷冰運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，將新鮮牡蠣洗凈，經(jīng)高速組織勻漿機(jī)斬拌均勻，于-20℃下冷凍備用；中性蛋白酶（6.0×104U/g）、木瓜蛋白酶 （1.0×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶 （1.0×105U/g）、胰蛋白酶 （2.5×105U/g），購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），購(gòu)于上海源葉生物有限公司；牛血清蛋白，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器

SHA-B型水浴搖床，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司產(chǎn)品；MINI8-UV型超純水機(jī)，湖南科爾頓水務(wù)有限公司產(chǎn)品；pH值計(jì)；MIKRO220R型高速冷凍離心機(jī)，Andreas Hettich GmbH&Co.KG產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；C21-SH2140型電磁爐（美的）；61010-1:2ND型冷凍干燥機(jī)，Kansascity，missouri產(chǎn)品；SpectraMax i3型酶標(biāo)儀，Molecullar debices產(chǎn)品；BL25B31型攪拌機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 牡蠣基本組成及氨基酸分析

水分測(cè)定：GB 5009.3—2016；灰分測(cè)定：GB 5009.4—2016；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：GB 5009.5—2016；脂肪測(cè)定：GB 5009.6—2016；氨基酸的分析：GB 5009.124—2016。

2.2 不同蛋白酶的酶解度、氮素回收率和抗氧化活性的影響

稱(chēng)取適量牡蠣肉糜按照料液比為1∶6加入超純水，在各蛋白酶最適溫度的恒溫水浴中均勻攪拌，保溫一段時(shí)間，調(diào)節(jié)pH值至最適值，每克肉糜中加入1 000 U活力的酶，時(shí)間為5 h。

牡蠣肉糜的酶解參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 牡蠣肉糜的酶解參數(shù)

每隔1 h取酶解液高溫滅酶，直至結(jié)束。調(diào)節(jié)酶解液pH值至7，低溫高速離心，收集上清液冷凍，測(cè)定指標(biāo)。

2.2.1 酶解度的測(cè)定

參照王雪芹等人的方法[8]。

2.2.2 氮素回收率的測(cè)定

參照王雪芹等人的方法。

2.2.3 牡蠣酶解液清除DPPH·活性

參照Hua D等人[9]的方法。

2.3 牡蠣多肽制備單因素試驗(yàn)

根據(jù)2.2的結(jié)果選酶。以加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值和料液比為因素，DPPH·清除率來(lái)評(píng)定單因素的最適條件。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化牡蠣酶解液的酶解工藝

使用Design Expert 8.0軟件對(duì)牡蠣抗氧化條件進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定優(yōu)化后的DPPH·清除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 牡蠣基本組成及氨基酸分析

牡蠣的一般營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

表2 牡蠣的一般營(yíng)養(yǎng)成分/%

由表2可知，牡蠣是一種高蛋白質(zhì)、低脂肪的食品材料。高脂肪的物質(zhì)在酶解中產(chǎn)生不良風(fēng)味，影響保質(zhì)期。一般情況下在酶解前會(huì)去除材料中所含的脂肪。不過(guò)此做法會(huì)增加生產(chǎn)成本，此外除脂肪的過(guò)程中殘留的試劑，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分變性，造成食品安全隱患。而牡蠣高蛋白、低脂肪的原料特點(diǎn)，使得它非常適于作為酶解底物，且無(wú)需進(jìn)行脫脂處理。

牡蠣中必需氨基酸的含量為35.35%，牡蠣中鮮味氨基酸的含量為45.42%。支鏈氨基酸含量達(dá)14.88%，能夠合成蛋白質(zhì)，在一些時(shí)期還可提供能量[10]，以及改善運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌的代謝[11]。牡蠣中幾種關(guān)鍵抗氧化氨基酸（His，Tyr，Met）占10.70%，說(shuō)明其具有潛在的抗氧化活性。

牡蠣肉糜組分的氨基酸組成分析見(jiàn)表3。

3.2 牡蠣多肽制備單因素試驗(yàn)

牡蠣肉糜各蛋白酶酶解產(chǎn)物的活性見(jiàn)圖1，不同蛋白酶對(duì)牡蠣DPPH·清除率的測(cè)定見(jiàn)圖2。

由圖1可知，酶解度在4 h達(dá)到一個(gè)最大值，在5 h則開(kāi)始下降，氮素回收率在4 h也較高。故測(cè)定酶解時(shí)間為4 h時(shí)的DPPH·的清除能力。4 h時(shí)，4種蛋白酶的酶解度達(dá)到最大值，氮素回收率也較高，中性蛋白酶的效果較高。因此，以中性蛋白酶作為最佳用酶。

3.2.1 加酶量

其他4個(gè)因素不變的情況下，中性蛋白酶加酶量的條件分別為1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 U/g。

加酶量對(duì)DPPH·清除率的影響見(jiàn)圖3。

表3 牡蠣肉糜組分的氨基酸組成分析

在一定范圍內(nèi)，DPPH·清除率隨著加酶量的增多先上升后下降，加酶量1 400 U/g達(dá)到最高值71.82%，若加酶量過(guò)低，則會(huì)導(dǎo)致底物酶解不徹底，若加酶量過(guò)多，會(huì)改變酶解液的顏色，產(chǎn)生不良?xì)馕?。所以選1 400 U/g為最適加酶量。

3.2.2 pH值影響

其他4個(gè)因素不變的情況下，pH值的條件分別為 6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。

pH值對(duì)DPPH·清除率的影響見(jiàn)圖4。

在pH值為7.0的時(shí)候達(dá)到最大值70.52%，由此得出在酸堿環(huán)境下都會(huì)影響其抗氧化活性，此外調(diào)節(jié)pH值也不利于后期的樣品處理。所以選擇pH值為7.0。

3.2.3 酶解溫度

其他4個(gè)因素不變的情況下，酶解溫度的條件分別為40，45，50，55，60℃。

酶解溫度對(duì)DPPH·清除率的影響見(jiàn)圖5。

酶解液在50℃時(shí)，DPPH清除率最高，為65.41%，溫度過(guò)低則蛋白酶的活性無(wú)法完全體現(xiàn)，而高溫會(huì)導(dǎo)致蛋白酶失活，所以選擇50℃為溫度。

3.2.4 酶解時(shí)間

其他4個(gè)因素不變的情況下，酶解時(shí)間的條件分別為 3，4，5，6，7 h。

圖1 牡蠣肉糜各蛋白酶酶解產(chǎn)物的活性

酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響見(jiàn)圖6。

酶解時(shí)間為4 h時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到最高值66.10%，之后開(kāi)始下降。倘若酶解時(shí)間過(guò)短，則底物無(wú)法完全水解，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，其風(fēng)味將發(fā)生改變，制備成本變高。所以選擇4 h為酶解時(shí)間。

3.2.5 料液比

其他4個(gè)因素不變的情況下，料液比為1∶3，1∶6，1∶10，1∶15，1∶20。

料液比對(duì)DPPH·清除率的影響見(jiàn)圖7。

當(dāng)料液比為1∶10，DPPH清除率達(dá)到最大值68.98%，在適宜條件下，增加料液比可促進(jìn)蛋白酶催化，但料液比過(guò)大時(shí)，導(dǎo)致蛋白酶濃度下降。所以選擇料液比為10∶1。

圖2 不同蛋白酶對(duì)牡蠣DPPH·清除率的測(cè)定

圖3 加酶量對(duì)DPPH·清除率的影響

圖4 pH值對(duì)DPPH·清除率的影響

圖5 酶解溫度對(duì)DPPH·清除率的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響

圖7 料液比對(duì)DPPH·清除率的影響

牡蠣酶解產(chǎn)物的各因素最優(yōu)條件見(jiàn)表4。

表4 牡蠣酶解產(chǎn)物的各因素最優(yōu)條件

3.3 牡蠣多肽制備的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

3.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平的選取

在單因素水平上，對(duì)pH值、料液比和酶解時(shí)間進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化。

響應(yīng)面分析法因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表5，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 響應(yīng)面分析法因素與水平設(shè)計(jì)

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表6試驗(yàn)結(jié)果得到二次回歸方程（1）：

清除率=75.17+1.35A+1.16B+2.06C-0.82AB-

1.31 AC+0.70BC-3.00A2-1.57B2-2.74C2.

其中A，B，C分別代表pH值、料液比和酶解時(shí)間。

響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表7。

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)作圖分析

pH值和料液比對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率影響見(jiàn)圖8。

圖8 pH值和料液比對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率影響

由圖8可知，料液比和pH值的相互作用不明顯，方差分析結(jié)果也表示作用不明顯。pH值恒定時(shí)，料液比的增加，DPPH·清除率先上升后下降，不過(guò)改變不明顯，料液比恒定時(shí)，DPPH·清除率隨著pH值的提高，先增大后減小，變化明顯，在7.0時(shí)清除率最大。

pH值和酶解時(shí)間對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率影響見(jiàn)圖9。

pH值為7.0時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，其DPPH·清除率先上升后下降，3 h和5 h時(shí)DPPH·清除率最低，而在4 h時(shí)DPPH·清除率最大。酶解時(shí)間特定時(shí)，DPPH·清除率隨pH值的升高也出現(xiàn)相同的變化。

酶解時(shí)間和料液比對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率影響見(jiàn)圖10。

圖9 p H值和酶解時(shí)間對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率影響

圖10 酶解時(shí)間和料液比對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率影響

由圖10可知，在酶解時(shí)間恒定時(shí)，隨著料液比的增加，DPPH·清除率先上升隨后下降，在料液比為1∶10時(shí)達(dá)到最高，從圖10可知料液比對(duì)DPPH·清除率的影響非常顯著。

3.3.3 響應(yīng)面法驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert軟件優(yōu)化后進(jìn)行分析，測(cè)定牡蠣酶解液最高DPPH·清除率，其條件為pH值7.08，酶解時(shí)間4.34 h，料液比1∶11.84。預(yù)計(jì)清除率75.84%，在此條件下進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后清除率為74.43%±0.32%，實(shí)際清除率和預(yù)計(jì)清除率無(wú)差異性（p＞0.05），擬合度較好。

4 結(jié)論

以牡蠣為研究對(duì)象，在中性蛋白酶酶解制備牡蠣多肽的的試驗(yàn)中，綜合考慮了酶解度、氮素回收率和DPPH·清除率等因素。發(fā)現(xiàn)加酶量、酶解時(shí)間、料液比、pH值、酶解溫度對(duì)DPPH·清除率具有一定影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DPPH·為優(yōu)化指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝。當(dāng)酶解溫度50℃，pH值7.0，酶解時(shí)間4 h，料液比1∶10，加酶量1 400 U/g，優(yōu)化后DPPH·清除率達(dá)到74.43%。