淡色庫蚊的弓形蟲實(shí)驗(yàn)感染初報(bào)

谷晨陽 李雅菁 趙奕涵 張學(xué)順 馮苗 劉世國

（1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院 河南 新鄉(xiāng) 453003）

（2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院 河南 新鄉(xiāng) 453003）

（3 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲教研室 河南 新鄉(xiāng) 453003）

弓形蟲是寄生于溫血類動(dòng)物和人類有核細(xì)胞內(nèi)的寄生原蟲，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，人類普遍易感，全世界將近三分之一的人感染弓形蟲[1]。弓形蟲感染途徑有多種：生食或半生食肉類或飲用卵囊污染的水源，胎兒可經(jīng)孕婦經(jīng)胎盤導(dǎo)致感染[2]。

蚊屬于雙翅目、蚊科，是對人類威脅最大的衛(wèi)生媒介昆蟲。蚊能兼吸人和動(dòng)物的血，能傳播多種人獸共患疾病，如常見的瘧疾、絲蟲病、流行性乙型腦炎、黃熱病和登革熱等疾患[3]。蚊蟲有多種，常見的有按蚊，庫蚊和伊蚊，其中，淡色庫蚊是北方地區(qū)夏季的優(yōu)勢吸血蚊種[4-5]。

蚊子在弓形蟲傳播中的作用至今尚未知曉。我們采用RH株弓形蟲建立小鼠弓形蟲感染模型。同時(shí)飼養(yǎng)當(dāng)?shù)貎?yōu)勢蚊種-淡色庫蚊，待雌蚊羽化交配后叮咬吸取弓形蟲感染小鼠血液，其后檢測吸血雌蚊體內(nèi)弓形蟲DNA?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

淡色庫蚊孑孓由野外捕捉。8周齡昆明小鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供；RH株弓形蟲速殖子為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室液氮保存的RH株種。此實(shí)驗(yàn)過程及動(dòng)物使用、護(hù)理方案通過了新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

飼養(yǎng)籠（35cm×35cm×35cm，120目），電動(dòng)吸蚊器、透明塑料杯、葡萄糖、小白鼠飼料、海綿、塑料盆等均為市售；2×UltraSYBR Mixture(High ROX)、2×Es Taq MasterMix(Dye)均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，蛋白酶K緩沖液購自美國Genview公司，Tris飽和酚購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 淡色庫蚊的養(yǎng)殖 采用標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖方法[6]，飼養(yǎng)條件為室溫（25±2）攝氏度，相對濕度為（65±15）%，光照周期為L∶D=14h∶10h。

1.3.2 弓形蟲小鼠感染模型的建立 RH株弓形蟲速殖子1×105個(gè)腹腔內(nèi)注射感染小鼠，建立弓形蟲感染小鼠模型，感染前小鼠尾部取血200μL，感染后每天均取血，加入EDTA保存。每天18∶00左右將小鼠固定于鼠板上，放入約100只成蚊(雌雄比例均衡，均選取羽化后兩至三天的成蚊，根據(jù)蚊蟲吸血高峰的調(diào)查，在此期間雌蚊處于第一個(gè)吸血高峰[7]，使其吸取小鼠血。第二天7∶00將所有蚊子取出，挑選出大部分已吸血的雌蚊，把雌蚊分別剪碎放入1.5mL離心管內(nèi)，加入ProK蛋白酶緩沖液500μL，對小鼠血液和吸血蚊組織采用酚-氯仿法提取DNA；另一小部分吸血蚊做成血涂片，以便顯微鏡下觀察弓形蟲滋養(yǎng)體。

1.3.3 弓形蟲529序列巢式PCR 分別以小鼠血液和吸血蚊組織DNA為模板，以弓形蟲速殖子DNA為陽性，以ddH2O為陰性,進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。

1.3.4 Real-timePCR弓形蟲蟲體量測定 以血液DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。外套引物F：5'-CGCTGCAGGAAGACGAAAGTTG-3'，R：5'-CGCTGCAGACACAGTGCA TCTGGATT-3',產(chǎn)物大小94bP，反應(yīng)體系為25μL：2×UltraSYBR Mixture(High ROX)12.5μL，TemPlate DNA 4μL，F(xiàn)orward Primer、Reverse Primer各0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃1.5min；72℃ 7min。以拷貝數(shù)為2.7×107、2.7×105、2.7×103、2.7×101弓形蟲RH株滋養(yǎng)體DNA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，ddH2O為空白對照。

2.結(jié)果

2.1 血涂片鏡檢

將部分吸血蚊做成血涂片，經(jīng)瑞氏染色后在顯微鏡下可見弓形蟲滋養(yǎng)體活體，結(jié)果如圖1、2。

圖1 吸血蚊血涂片1（瑞氏染色）

圖2 吸血蚊血涂片2（瑞氏染色）

2.2 定性檢測

2.2.1 小鼠感染情況 小鼠存活時(shí)長記為5天(在感染后在第四天陸續(xù)開始死亡，至第5天全部死亡)，對小鼠斷尾取血得到血液樣本共76個(gè)，其中陽性樣本55個(gè)，陽性率為77.37%。實(shí)驗(yàn)中對每天收集的小鼠血進(jìn)行PCR和凝膠電泳檢測后，18只小鼠在5天內(nèi)均至少有一天出現(xiàn)陽性條帶，結(jié)果見表1。

對實(shí)驗(yàn)小鼠每天感染情況使用χ2檢驗(yàn)顯示小鼠血陽性率與其感染天數(shù)有關(guān)(χ2=30.193,P＜0.001)。第一天的感染率低于后四天。通過多個(gè)樣本率比較，第一天與其余四天之間的陽性率有顯著性差異；但除第一天外其余四天間陽性率無顯著性 差異(χ21-2=13.486,P1-2=0.000；χ21-3=16.200,P1-3=0.000；χ21-4=17.578,P1-4=0.000；χ21-5=7.170,P1-5=0.007；χ22-3=0.232,P2-3=0.630；χ22-4=0.885,P2-4=0.347；χ22-5=0.000,P2-5=1.000；χ23-4=0.249,P3-4=0.618；χ23-5=0.127,P3-5=0.722；χ24-5=0.573,P4-5=0.449,critical valueχ20.005,1=7.88)。

天數(shù) 小鼠血例數(shù)（個(gè)） 陽性例數(shù)（個(gè)） 陽性率（%）第一天 18 4 22.22第二天 18 15 83.33第三天 18 16 88.89第四天 16 15 93.75第五天 6 5 83.33合計(jì) 76 55 72.37

2.2.2 吸血蚊感染情況 蚊蟲吸血實(shí)驗(yàn)時(shí)長為四天，共得到吸血蚊樣本共47個(gè)，其中陽性樣本28個(gè)，陽性率為59.57%，四天內(nèi)每天的吸血蚊感染情況見表2。

對實(shí)驗(yàn)吸血蚊每天感染情況使用χ2檢驗(yàn)顯示吸血蚊陽性率與小鼠感染天數(shù)無關(guān)(χ2=0.979,P=0.806)。另外，通過多個(gè)樣本率比較，四天間的陽性率無顯著性差異(χ21-2=0.033,P1-2=0.856；χ21-3=0.508,P1-3=0.476；

天數(shù) 吸血蚊數(shù)（只） 陽性數(shù)（只） 陽性率（%）第一天 16 10 62.50第二天 6 4 66.67第三天 16 8 50.00第四天 9 6 66.67合計(jì) 47 28 59.57

2.2.3 小鼠各自對應(yīng)吸血蚊情況 實(shí)驗(yàn)以供雌蚊吸血的小鼠共5只，每只小鼠對應(yīng)均有一定數(shù)量吸血蚊及陽性率，見表3。

吸血蚊數(shù)（只） 弓形蟲檢出數(shù)（只） 檢出率（%）一號小鼠 9 4 44.44二號小鼠 6 3 50.00三號小鼠 12 9 75.00四號小鼠 11 6 54.55五號小鼠 9 6 66.67

對吸血蚊陽性率使用χ2檢驗(yàn)顯示吸血蚊陽性率在小鼠間無差異(χ2=2.573,P=0.632)。通過多個(gè)樣本率比較，五只小鼠對應(yīng)吸血蚊的陽性率之間無顯著性差異(χ21-2=0.045,P1-2=0.833；χ21-3=2.036,P1-3=0.154；χ21-4=0.202,P1-4=0.653；χ21-5=0.900,P1-5=0.343；3=1.125,P2-3=0.289；χ22-4=0.032,P2-4=0.858；χ22-5=0.417,P2-5=0.519；χ23-4=1.059,P3-4=0.304；χ23-5=0.175,P3-5=0.676；χ24-5=0.303,P4-5=0.582,critical valueχ20.005,1=7.88)。

2.3 定量檢測

2.3.1 弓形蟲拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

標(biāo)準(zhǔn)品 CoPies lg CoPies (X) Ct value (Y)1 27 1.431364 33.02547 2 2700 3.431364 27.68513 3 270000 5.431364 22.29853 4 27000000 7.431364 15.72101

2.3.2 小鼠體內(nèi)弓形蟲拷貝數(shù)

天數(shù) 陽性小鼠平均拷貝數(shù)（μL-1）第一天 493.4751427第二天 5317.830137第三天 382214.4797第四天 3007580.570第五天 80016705.60

對小鼠血拷貝數(shù)使用方差分析顯示陽性小鼠血平均拷貝數(shù)與小鼠感染天數(shù) 有關(guān)(F=15.164,P＜0.0001)。通過多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較，五天間陽性小鼠血平均拷貝數(shù)有顯著性差異(F1-2=7.360,P1-2=0.027；F1-3=4.691,P1-3=0.067；F1-4=37.642,P1-4=0.000；F1-5=6.403,P1-5=0.085；F2-3=11.608,P2-3=0.006；F2-4=95.246,P2-4=0.000；F2-5=19.364,P2-5=0.003；F3-4=54.444,P3-4=0.000；F3-5=15.853,P3-5=0.007；F4-5=14.813,P4-5=0.008)。

2.3.3 吸血蚊體內(nèi)弓形蟲拷貝數(shù)

天數(shù) 陽性吸血蚊平均拷貝數(shù)第一天 1657.001814第二天 1800.813196第三天 1513.882144第四天 1145.478119合計(jì) 1529.293818

對吸血蚊拷貝數(shù)使用方差分析顯示陽性吸血蚊平均拷貝數(shù)與小鼠感染天數(shù)無關(guān)(F=0.457,P=0.717) 。通過多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較，四天間陽性吸血蚊平均拷貝數(shù)無顯著性差異。(F1-2=0.056,P1-2=0.818；F1-3=0.033,P1-3=0.861；F1-4=0.915,P1-4=0.361；F2-3=0.235,P2-3=0.661；F2-4=4.357,P2-4=0.091；F3-4=0.431,P3-4=0.547)。

3.討論

通過實(shí)驗(yàn)研究顯示，小鼠血樣本感染率為77.37%，弓形蟲在小鼠血液中的含量隨著感染時(shí)間的增加而增加(F=15.164,P＜0.0001)，結(jié)果與先前Zenner[9]報(bào)道的研究結(jié)果一致。我們的研究通過建立了急性弓形蟲感染的小鼠模型，論證了弓形蟲在小鼠血液中的含量隨小鼠感染時(shí)間的增加而增加。

先前業(yè)已有很多關(guān)于弓形蟲傳播途徑的報(bào)道，主要包括先天性感染[10]和獲得性感染[11-12]。獲得性感染有多種途徑，尤其是口腔感染；器官及骨髓移植或輸血感染；性感染。

有研究表明，兩種常見的節(jié)肢動(dòng)物∶蠅[13]和蟑螂[14]，它們具有攜帶弓形蟲的能力。在中國北部和中部地區(qū)，淡色庫蚊是一種最常見的節(jié)肢動(dòng)物，它能夠傳播多種病毒和寄生蟲等。然而，到目前為止還沒有任何關(guān)于蚊能夠傳播弓形蟲的報(bào)道。我們通過建立小鼠急性弓形蟲感染模型得到目標(biāo)吸血蚊。首先我們制作吸血蚊血涂片，鏡下發(fā)現(xiàn)弓形蟲滋養(yǎng)體活體。然后通過吸血蚊DNA樣本，我們發(fā)現(xiàn)在蚊體中存在529基因，其平均陽性率為59.57%；此外，陽性吸血蚊體內(nèi)的弓形蟲含量與小鼠感染天數(shù)無關(guān)(F=0.457,P=0.717)，平均每只蚊子的弓形蟲拷貝數(shù)為1529.3/只。此外，StePhanie的研究表明西尼羅病毒在蚊子體內(nèi)的含量趨于一定值。在我們研究中弓形蟲的變化趨勢與西尼羅病毒類似[15]，這一現(xiàn)象說明弓形蟲在蚊體內(nèi)的變化趨勢可能類似于西尼羅病毒，但這需要進(jìn)一步的探索。

我們的實(shí)驗(yàn)表明,小鼠感染后第一、二天陽性吸血蚊體內(nèi)弓形蟲的含量高于陽性小鼠血液內(nèi)含量,小鼠感染后第三、四天陽性吸血蚊體內(nèi)弓形蟲的含量低于陽性小鼠血液內(nèi)含量。Williams[16]提到蚊子在吸血過程中會(huì)有液滴的排出現(xiàn)象。因此，我們推測蚊子可能在液滴排出時(shí)對弓形蟲有富集現(xiàn)象，這可能解釋了在小鼠感染后前兩天蚊體內(nèi)弓形蟲含量高的現(xiàn)象。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)淡色庫蚊可攜帶弓形蟲活體，且弓形蟲在蚊子體內(nèi)的含量趨于一定值。然而,在蚊吸血后正常生存狀態(tài)下，弓形蟲在其體內(nèi)存活情況及變化情況仍不清楚。蚊是否是弓形蟲在動(dòng)物間傳播的媒介還有待進(jìn)一步研究。