葛根素防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究進展▲

周昊楠 陳遠明

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧市 530001，電子郵箱：zzhhnnyy@163.com； 2 廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科，南寧市 530007)

【提要】 葛根素又稱葛根黃素，是從天然植物葛根中分離的單體化合物，具有異黃酮結構，與雌激素結構類似，主要存在于豆科植物葛及野葛的根中。目前臨床上主要用于防治冠心病、心絞痛、高血壓。近年來，越來越多的體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，葛根素作為一種植物雌激素，具有抑制破骨細胞分化、促進成骨細胞生成、增加骨量、改善骨代謝的作用。本文對近十年來葛根素防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究進展進行綜述。

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性疾病，涉及全身骨骼。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥分為老年性骨質(zhì)疏松癥與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)，PMOP是女性絕經(jīng)后的常見病之一。目前學者們認為PMOP主要是卵巢功能衰退，雌激素水平下降，骨吸收大于骨形成，進而導致骨量減少以及骨組織顯微結構退行性變，臨床表現(xiàn)為骨脆性增加、易骨折、骨骼易變形、骨折不愈合等，對老年人身心健康造成嚴重影響[1]。其中雌激素缺乏是絕經(jīng)后女性骨丟失的主要原因。已有臨床研究證明雌激素或雌孕激素聯(lián)合治療PMOP的療效顯著，該療法能維持并提高骨密度，降低骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生風險，是防治PMOP的有效手段[2]。但長期使用雌激素有促子宮內(nèi)膜增生和增加冠心病、腦卒中、肺栓塞、乳腺癌等發(fā)生率的風險。有學者提出采用植物雌激素，如葛根素等替代雌激素治療PMOP。本文對近十年來葛根素防治PMOP的研究進展進行綜述。

1 葛根素的理化性質(zhì)及藥理作用

自20世紀50年代葛根素被分離鑒定以來，其作為一種從野葛根中提取出來的異黃酮類植物提取物，被廣泛用于臨床研究和動物實驗研究，現(xiàn)已被認為是一種重要的植物雌激素。葛根素化學名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羥基異黃酮，分子式為C21H20O9，相對分子質(zhì)量為416.38，化學結構式見圖1。常溫常壓下低含量的葛根素為棕色粉末，高含量葛根素為白色針狀結晶粉末。目前，我國批準的葛根素劑型主要有注射劑和滴眼液2種，更多新劑型也在不斷開發(fā)與改進[3]。葛根素的藥理作用主要有：保護臟器組織、抗缺血再灌注損傷、改善血液流變學指標、調(diào)控骨代謝、抑制鈣超載、降眼壓、雌激素樣作用等，適用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、視網(wǎng)膜動靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾等疾病的治療，療效顯著[4]。

圖1 葛根素的化學結構式

2 葛根素防治PMOP的細胞實驗研究

關于葛根素對成骨細胞的影響，國內(nèi)外眾多學者做了大量的研究。王建華等[5]發(fā)現(xiàn)葛根素在體外能促進成大鼠骨細胞的增殖與分化。王久亮等[6]進一步證實了葛根素對骨形成的作用：一是通過提高堿性磷酸酶活性進而促進成骨細胞分化；二是通過雌激素受體介導促進成骨細胞的骨形成效應。劉永慶等[7]發(fā)現(xiàn)葛根素和國產(chǎn)多孔鉭支架能協(xié)同促進成骨細胞Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen，COL-Ⅰ)、骨鈣素的表達，從而促進成骨細胞的增殖。也有學者發(fā)現(xiàn)表面結合葛根素的鈦合金可以促進前成骨細胞成骨分化[8]。王昌等[9-11]發(fā)現(xiàn)葛根素對Wistar大鼠的成骨細胞的影響存在劑量依賴性，并且具有雙向性，即在低濃度(10-8～10-5mol/L)下促進骨形成，在高濃度(10-4～10-3mol/L)下抑制骨形成；并且其在之后的研究中發(fā)現(xiàn)葛根素在體外對過氧化氫介導的Wistar大鼠成骨細胞氧化損傷具有保護作用。Suthon等[12]亦證實了葛根素的抗骨質(zhì)疏松作用具有時間依賴性、劑量依賴性及雙向性。林樹忠等[13]的實驗結果表明葛根素在40 μmol/L和80 μmol /L濃度時可促進礦化結節(jié)形成，證實葛根素對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞有明顯的促進增殖作用。孫玉敏等[14]采集并培養(yǎng)老年女性骨質(zhì)疏松癥患者股骨頸松質(zhì)骨成骨細胞，發(fā)現(xiàn)葛根素能夠提高成骨細胞堿性磷酸酶及骨鈣素活性，具有明顯的促進成骨細胞分化成熟的作用，且0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol /L的葛根素可呈濃度依賴性促進老年女性骨質(zhì)疏松癥患者成骨細胞增殖。Wang等[15]體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)葛根素可以促進成骨生成和抑制脂肪生成。Liang等[16]發(fā)現(xiàn)葛根素對于糖尿病性骨質(zhì)疏松癥具有一定的保護作用，這種保護作用可能是通過抑制半胱天冬酶-3的表達產(chǎn)生。盧宇等[17]發(fā)現(xiàn)葛根素可以抑制吡格列酮誘導的成骨細胞凋亡。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)葛根素能刺激堿性磷酸酶活性，促進COL-Ⅰ分泌以及原代成骨細胞礦化結節(jié)形成，而雌激素受體抑制劑則可以減少由葛根素誘導的堿性磷酸酶活性增加和COL-Ⅰ的分泌量；此外，葛根素可呈時間依賴性地提高p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和β-鏈蛋白的水平，而葛根素提高p38 MAPK和β-鏈蛋白水平的作用受到雌激素受體抑制劑的抑制，但其提高β-鏈蛋白水平的作用不受p38 MAPK抑制劑影響。這表明雌激素受體、p38 MAPK和Wnt/β-鏈蛋白途徑都與葛根素誘導成骨細胞分化以及骨形成有關。于冬冬等[19-20]發(fā)現(xiàn)葛根素通過半胱天冬酶調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路，抑制地塞米松誘導的hFOB 1.19人成骨細胞凋亡；通過p38 MAPK通路，抑制地塞米松誘導的MC3TE-E1小鼠成骨細胞株細胞凋亡。趙艷威等[21]發(fā)現(xiàn)葛根素可通過促進人成骨樣細胞系MG-63細胞中堿性磷酸酶活性和COL-Ⅰ分泌，促進成骨細胞分化成熟，該作用可被純雌激素受體阻斷劑ICI 182,780完全阻斷，微小RNA干擾實驗結果進一步證實葛根素對成骨細胞堿性磷酸酶活性、COL-Ⅰ分泌的調(diào)節(jié)作用是由雌激素受體α和雌激素受體β共同介導的。此外，Wang等[22]還發(fā)現(xiàn)葛根素促進人成骨細胞增殖分化的作用是通過激活絲裂原細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)和磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號實現(xiàn)的，Liu等[23]亦證實葛根素通過ERK信號傳導通路抑制人成骨細胞的凋亡,還有學者也證實了葛根素促進大鼠成骨細胞的骨形成可能是通過激活PI3K/Akt途徑來調(diào)節(jié)的[24]。張瑩瑩等[25-26]發(fā)現(xiàn)葛根素可促進小鼠成骨細胞增殖，并通過下調(diào)靶向Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)的微小RNA的表達來提高RUNX2表達水平。Sheu等[27]認為葛根素可能通過誘導骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)和一氧化氮合成，進而調(diào)節(jié)成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1/RUNX2、成骨細胞骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor κB ligand，RANKL)基因的表達來發(fā)揮誘導成骨細胞增殖分化、促進骨形成的作用，而且當葛根素濃度為10-8mol/L時，成骨細胞分化能力達到最強。Shan等[28]發(fā)現(xiàn)葛根素通過miR-106b調(diào)節(jié)RANKL基因促進MC3T3-E1小鼠成骨細胞成骨分化。羅婷等[29]發(fā)現(xiàn)葛根素可明顯抑制人成骨樣細胞系MG-63細胞白細胞介素(interleukin，IL)-6表達和IL-6基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，并且該作用可被純雌激素受體阻斷劑ICI 182，780部分阻斷，微小RNA干擾實驗結果進一步證明葛根素通過雌激素受體α實現(xiàn)對成骨細胞IL-6的抑制作用。Lv等[30]的實驗顯示，葛根素可能通過一氧化氮/環(huán)磷酸鳥苷信號通路誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)增殖和成骨分化。Wang等[31]發(fā)現(xiàn)葛根素可以在體內(nèi)外抑制BMSCs的脂肪分化，防止酒精誘發(fā)性骨壞死。蔡花等[32]發(fā)現(xiàn)葛根素能促進臍帶間質(zhì)干細胞向成骨分化。也有學者發(fā)現(xiàn)葛根素通過ERK1/2和p38-MAPK途徑促進BMSCs增殖分化[33]。

除了促進成骨分化，葛根素還能作用于破骨細胞，抑制骨吸收。詹秀琴等[34]發(fā)現(xiàn)葛根素可刺激成骨細胞信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad2/3 mRNA的表達和刺激轉(zhuǎn)化生長因子β1的分泌和合成，從而促進骨形成，抑制骨吸收。Tiyasatkulkovit等[35]通過研究葛根素對骨肉瘤細胞UMR106的作用，發(fā)現(xiàn)葛根素可以使骨肉瘤細胞堿性磷酸酶mRNA表達上調(diào)，促進成骨細胞分化，從而增加骨形成；之后采用狒狒成骨細胞進行實驗[36]，發(fā)現(xiàn)葛根素可促進成骨細胞的增殖和堿性磷酸酶以及COL-Ⅰ的表達，并且減少破骨細胞介導的骨吸收。也有學者[37]發(fā)現(xiàn)葛根素可以抑制脂多糖誘導的破骨細胞分化，通過抑制破骨細胞活化因子腫瘤壞死因子-α、IL-1β、小鼠前列腺素E2，抑制破骨細胞原基因(包括抗磷酸酯酶、組織蛋白酶K以及基質(zhì)金屬蛋白酶9)的表達，并且葛根素能抑制破骨前體細胞RAW264.7被脂多糖激活而產(chǎn)生Akt。劉浩等[38]發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量、濃度葛根素在體外對1，25-(OH)2D3促破骨細胞骨吸收功能均有抑制作用，其最佳抑制劑量在10～50 μg/L。袁斯遠等[39]采用小鼠成骨細胞進行實驗，發(fā)現(xiàn)葛根素和雌二醇能夠延長細胞堿性磷酸酶表達時間，在第12天達到高峰；在第10天和第12天能夠增加細胞骨涎蛋白mRNA的表達；在第5天和第12天能夠減少細胞骨橋蛋白的表達；在第10天和第12天能夠增強細胞骨鈣素表達。這說明葛根素能夠通過影響成骨細胞分化相關特征性蛋白mRNA的表達，促進成骨細胞的分化，這可能是葛根素抗骨質(zhì)疏松的重要細胞分子機制之一；其之后的實驗顯示，與空白對照組相比，葛根素組小鼠成骨細胞RANKL mRNA表達降低，OPG/RANKL mRNA表達升高[40]。因此得出結論：葛根素能夠直接抑制破骨細胞形成和上調(diào)成骨細胞OPG/RANKL mRNA表達而間接調(diào)控破骨細胞，這可能是葛根素抗骨吸收作用的重要細胞分子機制；且葛根素不會造成子宮重量增加[41]。

3 葛根素防治PMOP的動物實驗研究

Tanaka等[42]發(fā)現(xiàn)葛根藤的乙醇提取物(Pueraria lobata vine ethanol extracts，PVEE)由約80%的纖維，10%的葛根素，3.6%的黃豆苷，2.5%的丙二酰大豆黃甙，以及其他的小異黃酮組成；與喂食普通食物的卵巢摘除小鼠相比，喂食含PVEE食物的卵巢摘除小鼠的骨吸收標記物顯著減少，股骨遠端成熟破骨細胞數(shù)量也相應減少，且股骨礦物質(zhì)密度的減少受到抑制。PVEE還顯示出弱雌激素作用[42]，但抑制骨質(zhì)疏松效應主要由葛根素產(chǎn)生，抑或是多種成分交互作用，仍需要進一步驗證。

IL-6 是一種骨吸收刺激因子，主要作用于破骨細胞前體細胞，促使其向破骨細胞分化，發(fā)揮骨的重吸收作用。IL-6能刺激成骨細胞中RANKL的表達，通過RANKL與核因子κB受體活化因子相互作用，促進破骨細胞分化，從而促進骨吸收[3]。羅顯祿[43]給予卵巢摘除Wistar大鼠不同劑量的葛根異黃酮灌胃，結果顯示葛根異黃酮能明顯增加股骨中點及遠心端骨密度，升高血清胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)水平，降低血清IL-6水平，并且能較好地增加成骨細胞BMP-2表達水平。這表明葛根異黃酮能夠改善骨質(zhì)疏松，可能與下調(diào)IL-6表達水平和提高成骨細胞BMP-2的表達有關。Wang等[44]亦證實葛根素能抑制RANKL和IL-6產(chǎn)生。Park等[45]發(fā)現(xiàn)葛根素通過下調(diào)環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子1β、原癌基因蛋白c-Fos和活化T細胞核因子胞漿1型等信號因子，抑制RANKL調(diào)節(jié)的破骨細胞生成。周強等[46]研究結果顯示，葛根素可以通過調(diào)節(jié)IGF-1的表達，從而加快卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松性骨折的愈合。有研究證實葛根素屬的異黃酮類植物雌激素能夠增加卵巢摘除大鼠的骨密度，可有效防治卵巢摘除大鼠的骨量丟失，具有類雌激素樣作用，但增加子宮重量的作用不明顯，因此用于治療PMOP有較好的安全性[47]。研究證實葛根素對卵巢摘除大鼠的骨質(zhì)疏松癥有良好治療效果，但對鉛中毒所致的骨質(zhì)疏松癥無效，且小劑量的雌二醇聯(lián)合葛根素對卵巢摘除大鼠的治療效果，與單獨使用較大劑量的葛根素或較大劑量的雌二醇的治療效果相近，且25 mg/kg、1次/d葛根素+100 μg/kg、2次/周雌二醇是治療卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松的最佳搭配劑量[48-55]；而小劑量雌二醇與葛根素聯(lián)合或較大劑量葛根素對卵巢摘除大鼠子宮內(nèi)膜、肌層和腺體、陰道上皮和肌層的促增生作用較弱，且葛根素治療卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松癥對其腎功能也無明顯影響，但較大劑量雌二醇可明顯促進卵巢摘除大鼠陰道上皮和肌層增生[56-58]。王新祥等[59]的實驗也證實葛根雖然不具有雌二醇顯著刺激子宮重量增加的作用，但具有與雌二醇相當?shù)目构琴|(zhì)疏松作用。劉浩等[60]發(fā)現(xiàn)葛根素可以通過刺激成骨細胞的增殖和分化增強骨的形成，同時對脂肪的分化有輕微的抑制作用；對卵巢摘除大鼠采用葛根素聯(lián)合鋅治療能在一定程度上逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松，且未見明顯增加子宮重量和IGF-1蛋白質(zhì)表達，子宮內(nèi)膜腺上皮也未見明顯增生[61-62]。張明宇等[63]發(fā)現(xiàn)葛根素不僅能在體外促進成骨細胞增殖和分化，且將成骨細胞植入大鼠背部肌肉后，肌肉注射葛根素組的成骨率高于未注射葛根素的對照組。黃彤等[64-65]用含不同劑量葛根素的飼料喂養(yǎng)大鼠，結果發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)葛根素的各組小鼠其脛骨骨礦含量、骨鈣含量、股骨密度和肱骨所能承受的最大壓力明顯高于喂養(yǎng)不含葛根素飼料的模型組，說明服用葛根素后大鼠骨量、骨強度增加，血清骨吸收亢進引起的相關骨代謝指標水平得到改善。Cho等[66]用含葛根素飼料喂養(yǎng)卵巢摘除大鼠，結果發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中17β-雌二醇含量明顯增高，而甘油三酯水平、腹部脂肪組織重量明顯下降，肝內(nèi)酶含量無明顯變化，骨密度的減少受到顯著抑制；同時，實時定量PCR檢測分析結果顯示芳香酶基因表達受到抑制，而雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶SULT1E1基因表達增強，表明葛根素具有雌激素樣作用，且不會增加大鼠患乳腺癌的風險。Chen等[67]發(fā)現(xiàn)采用葛根素治療可以改善宮內(nèi)生長受限大鼠的骨質(zhì)流失情況。鄭紅星等[68]發(fā)現(xiàn)葛根異黃酮與維生素D3聯(lián)合給藥，對卵巢摘除骨質(zhì)疏松大鼠骨組織的修復作用優(yōu)于葛根異黃酮單獨給藥。

4 葛根素防治PMOP的臨床研究

目前關于葛根素防治PMOP的臨床研究開展較少。李俊華等[69]采用葛根素治療PMOP患者，結果顯示用藥30 d后血清IL-4、IL-6下降、IL-10含量上升，且體內(nèi)雌激素含量無顯著變化，說明葛根素可以在一定程度上替代雌激素作為PMOP的治療藥物。Manonai等[70]給予健康的絕經(jīng)后婦女20 mg、30 mg、50 mg葛根素膠囊(葛根素組)或同等劑量安慰劑(對照組)治療24周，結果顯示與對照組相比，葛根素組血中堿性磷酸酶含量顯著下降，而葛根素治療組和安慰劑組都沒有出現(xiàn)子宮內(nèi)膜增生，乳腺組織、全血細胞計數(shù)、肝腎功能沒有顯著變化，因此可以認為葛根素在骨代謝方面具有類雌激素樣作用，但未表現(xiàn)雌激素副作用。

5 總結與展望

中藥是傳統(tǒng)醫(yī)學的巨大寶庫，葛根素用于防治PMOP值得我們深入研究。目前關于葛根素抗骨質(zhì)疏松的實驗研究主要集中于細胞實驗和動物實驗。各實驗都證實葛根素能促進成骨細胞增殖分化，抑制破骨細胞，促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，促進骨形成，提高骨密度。多數(shù)學者認為葛根素具有類雌激素樣作用，但日本學者Michihara等[71]認為葛根素的抗骨質(zhì)疏松作用并不是通過雌激素受體途徑實現(xiàn)的，因此關于葛根素防治骨質(zhì)疏松的分子機制仍需要更強有力的證據(jù)。此外，脂肪組織與骨髓在胚胎發(fā)育過程中均源自中胚層，脂肪干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞均來自中胚層的成體干細胞，脂肪干細胞可以誘導脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞等，分化成何種細胞與誘導因子和外部環(huán)境有關[72]。那么葛根素能否誘導脂肪干細胞成骨分化呢？目前關于葛根素誘導脂肪干細胞，特別是人脂肪干細胞成骨分化的研究不多，有待我們更進一步深入地探索。