急性心肌梗死恢復(fù)期患者腸道微生物菌群變化研究

王 超,劉亞忠,孫亞偉

0 引言

急性心肌梗死是心血管內(nèi)科常見(jiàn)疾病之一。已有研究表明，約有70%的急性心肌梗死患者存在不同程度的腸道屏障功能受損，若不治療，可能會(huì)誘發(fā)腸道菌群移位，從而導(dǎo)致內(nèi)毒血癥的發(fā)生、發(fā)展。腸道菌群是人體內(nèi)強(qiáng)大微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在營(yíng)養(yǎng)、代謝及疾病方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1-2]。本研究選取2017年5月至2018年5月我院收治的急性心肌梗死恢復(fù)期的43例患者作為研究組，同時(shí)選取43名健康人作為對(duì)照，觀察急性心肌梗死患者恢復(fù)期腸道微生物菌群變化情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2018年5月我院收治的急性心肌梗死恢復(fù)期患者43例(研究組)，男21例，女22例，年齡36～78歲，年齡(52.3±2.4)歲，體重76.2～86.6 kg，體重(78.6±1.8)kg。前壁梗死18例，后壁梗死9例，下壁梗死16例；心力衰竭17例，心律失常19例，心源性休克7例；復(fù)發(fā)17例，首發(fā)26例。采用植物乳桿菌 F22 菌液進(jìn)行治療，所有患者均無(wú)其他方面疾病。健康組43例，男23例，女20例，年齡36～79歲，平均(53.2±2.6)歲，體重77.1～87.9 kg，平均(78.1±1.7)kg。兩組一般資料具有可比性，并知情同意，同時(shí)經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

病例納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：①患者均處于急性心肌梗死恢復(fù)期；②神志清晰、可正常溝通交流、有一定文化的患者；③患者無(wú)精神異常。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者同時(shí)患有其他方面的嚴(yán)重疾??；②溝通存在障礙，依從性差；③患者有明顯的精神疾患。

1.2 方法 于采樣前一天晚上7點(diǎn)后禁食、禁水，晨起進(jìn)行空腹血樣采集，采2 ml肘部靜脈血液，并進(jìn)行血清分離。

每位患者留取50 g新鮮清潔的糞便，將冰箱溫度設(shè)置在-80 ℃，把糞便樣本放置其中保存，并進(jìn)行統(tǒng)一檢測(cè)。試劑盒采用美國(guó)生產(chǎn)的Stool DNA kit試劑盒，提取糞便樣本中的DNA，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；對(duì)糞便菌群DHA的腸道菌群進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，以16SrRNA基因V3區(qū)呈現(xiàn)的特異性序列為靶標(biāo)，以518R：5′-ATTACCGCGGCTGG-3′作為引物序列，CG-338F：5′-CGCCCGGGGCG-CGCCCCGGGCGGGGC-GGGGGCACGGGGGGCCT-ACGGGAGGCAGCAG-3′在此基因中GC夾為“CGC-CCGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGG-GGGG”。Dream Taq Green PCR Master Mix 25 μl為PCR的擴(kuò)增反應(yīng)體系統(tǒng)，(10 pmol/μl)1 μl為上游引物，(10 pmol/μl)1 μl為下游引物，DNA模板為3 μl，將其去離子水(Nuclease-free)進(jìn)行補(bǔ)足，使其總體積達(dá)到50 μl，進(jìn)行5 min的預(yù)變性，溫度為94 ℃；30 s變性，溫度持續(xù)保持在94 ℃，采用30 s的退火處理，溫度降至54 ℃，進(jìn)行30 s的延伸處理，溫度為72 ℃，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。

延伸處理5 min，溫度為72 ℃，最后15 min溫度降至為4 ℃，該程序?yàn)镻CR擴(kuò)增的反應(yīng)程序。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，待PCR反應(yīng)完成后，用含溴化乙錠1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。使其產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳電壓設(shè)定為80 V，時(shí)間為20 min，采用UVI全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳后的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，目的條帶長(zhǎng)度約為250 bp。

變性梯度凝膠電泳時(shí)，聚丙烯酰胺凝膠含量為8%，平行電泳變性梯度在25%～55%之間，其中包含40%(v/v)的去離子甲酰胺及7 mol/L尿素，以上為100%變性梯度。采用微量進(jìn)液器給以5 μl點(diǎn)樣。進(jìn)行電泳時(shí)先進(jìn)行預(yù)電泳，使用1×TAE緩沖液，電壓為200 V，溫度設(shè)定在60 ℃下進(jìn)行，時(shí)間持續(xù)10 min以上，然后將固定電壓調(diào)成150 V，溫度依然保持在60 ℃下進(jìn)行電泳，時(shí)間為4.5 h。隨后采用EB進(jìn)行10 min的染色，然后放置去離子水中進(jìn)行5 min的漂洗。最后成像時(shí)采用UVI全自動(dòng)凝膠系統(tǒng)成像，相似分析時(shí)利用QuantityOne軟件進(jìn)行[4-5]。

對(duì)研究組進(jìn)行急性心肌梗死針對(duì)性治療，并于治療后72 h的病情緩解期內(nèi)再次檢測(cè)患者腸道菌群數(shù)量變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸道微生物菌群比較 研究組乳酸菌、雙歧桿菌、總厭氧菌數(shù)量均少于對(duì)照組(P<0.05)，而腸桿菌、腸球菌、總需氧菌數(shù)量多于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 研究組治療前后腸道微生物菌群比較 治療72 h后，研究組乳酸菌、雙歧桿菌、總厭氧菌數(shù)量增加(P<0.05)，腸桿菌、腸球菌和總需氧菌數(shù)量減少(P<0.05)，見(jiàn)表3。

3 討論

急性心肌梗死的主要危險(xiǎn)因素包括三高人群、吸煙及家族遺傳。目前研究認(rèn)為，炎癥也有可能引發(fā)心肌梗死。冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，而來(lái)自G-菌細(xì)胞壁的脂多糖有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的效果。有研究認(rèn)為，脂多糖的增多與腸道菌群失調(diào)有著密切聯(lián)系，由于腸道微生物菌群失調(diào)促使脂多糖增加，導(dǎo)致了慢性炎癥性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生[6-7]。有報(bào)道，患者出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，其腸道菌群也會(huì)發(fā)生變化[8]。本文探究了急性心肌梗死恢復(fù)期患者腸道微生物菌群變化情況。

表1 兩組腸道微生物菌群比較(lgCFU/g)

表2 研究組治療前后腸道微生物菌群比較(lgCFU/g)

本研究結(jié)果顯示，研究組乳酸菌、雙歧桿菌、總厭氧菌數(shù)量均少于健康對(duì)照組，而腸桿菌、腸球菌、總需氧菌數(shù)量多于對(duì)照組，表明研究組急性心肌梗死患者有明顯的腸道菌群紊亂，與以往研究結(jié)果相近[9]。同時(shí)，亦有研究結(jié)果顯示，腸道微生物菌群的失調(diào)會(huì)促使心肌梗死的發(fā)生[10]。若患者有炎癥性腸炎，則出現(xiàn)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此，腸黏膜功能受損會(huì)促進(jìn)心肌梗死的發(fā)生[11]。由于腸屏障功能出現(xiàn)損傷會(huì)加重腸黏膜的通透性，循環(huán)系統(tǒng)容易受到腸道細(xì)菌及其產(chǎn)物的入侵，從而使患者出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[12-13]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用過(guò)多含脂肪或膽固醇的食物，會(huì)使其腸上皮細(xì)胞酶在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生急性炎癥反應(yīng)[14]。究其原因，可能為腸道微生物菌群失調(diào)，同時(shí)，益生菌減少時(shí)，食物中的膽堿會(huì)通過(guò)腸道內(nèi)細(xì)菌消化后產(chǎn)生三甲胺，而三甲胺經(jīng)過(guò)肝臟的代謝會(huì)產(chǎn)生三甲胺-N-氧化物。該氧化物不但會(huì)使冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化，也會(huì)使心腦血管的相關(guān)疾病發(fā)生率顯著增加[15]。

本研究顯示，治療72 h后，研究組患者腸道微生物菌群有了顯著改善，表明在對(duì)急性心肌梗死患者治療的同時(shí)，也可改善了患者腸道微生物菌群的分布。急性心肌梗死可造成腸道微生物失調(diào)，而腸道微生物失調(diào)在一定程度上又可加重急性心肌梗死的嚴(yán)重程度。因此，在急性心肌梗死患者的治療過(guò)程中，應(yīng)注意調(diào)節(jié)其腸道菌群。目前，對(duì)腸道微生物菌群在機(jī)體代謝以及與機(jī)體發(fā)生作用的機(jī)制尚不明確。本文由于病例所限，沒(méi)有進(jìn)行更加深入的研究，后續(xù)會(huì)加大樣本量進(jìn)行相關(guān)研究。

綜上所述，急性心肌梗死患者出現(xiàn)了明顯的腸道微生物菌群紊亂，經(jīng)過(guò)治療后，急性心肌梗死恢復(fù)期患者腸道菌群紊亂得到明顯改善。因此，在進(jìn)行急性心肌梗死治療時(shí)，應(yīng)注意對(duì)患者腸道菌群的糾正，以防止膿毒血癥、感染、休克等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。