右美托咪定對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其機(jī)制*

劉煜鑫, 閆 東

(1. 重慶永川區(qū)兒童醫(yī)院麻醉科, 重慶 402160; 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院麻醉科， 重慶 402160)

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，α2-腎上腺素受體的親和力是可樂(lè)定的8倍[1-3]。右美托咪定廣泛用于臨床麻醉的輔助藥物。隨著全身麻醉在臨床中的應(yīng)用，近年來(lái)越來(lái)越多的研究關(guān)注全身麻醉藥物的中心毒性作用，特別是在神經(jīng)元的發(fā)育上，這對(duì)嬰兒具有重要意義。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為神經(jīng)因子家族的重要成員，通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化來(lái)調(diào)節(jié)和維持神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能。突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的重要途徑，其結(jié)構(gòu)由突觸前膜，突觸間隙和突觸后膜組成。神經(jīng)元以突觸的形式形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程中起重要作用。BDNF與酪氨酸受體激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)特異性結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致下游關(guān)鍵激酶磷酸化，促進(jìn)BDNF在神經(jīng)元和樹(shù)突中的表達(dá)，激活BDNF-TrkB信號(hào)通路，BDNF在突觸前調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4-6]。本研究通過(guò)分離和培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元，探討了DEX對(duì)新生大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)及BDNF-TrkB信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響，為研究DEX對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育影響提供數(shù)據(jù)支持。突觸素(synaptophysin，SYN)分布于突觸前膜，突觸后致密物95蛋白(PSD95)位于突觸后結(jié)構(gòu)中，這些突觸特異性蛋白標(biāo)志物可以直接或間接反映突觸活動(dòng)，形態(tài)學(xué)改變和突觸的生物學(xué)功能[7-8]。本研究分析了新生大鼠海馬神經(jīng)元的活性和凋亡情況，進(jìn)一步研究DEX通過(guò)BDNF-TrkB信號(hào)通路發(fā)揮的生物學(xué)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，CCK8試劑盒(南京凱基生物有限公司)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，TUNEL試劑盒(南京諾唯贊生物有限公司)，RNA純化試劑盒(天根生化科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher)，Neurobasal培養(yǎng)基、B27添加劑(Gibco)，谷氨酰胺、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗和單克隆抗體TrkB、NMDAR、p-NMDAR、GAPDH、BDNF均購(gòu)于Abcam公司。

主要儀器：光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX53)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific系列8000)，核酸定量?jī)x器(Nanodrop 2000)和熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Bio systems 7500)

1.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離與培養(yǎng)

新生大鼠分娩后24 h內(nèi)通過(guò)頸椎脫臼處死，然后將新生大鼠置于75%乙醇中2 min，去除老鼠頭部的皮膚和頭骨，取出整個(gè)大腦。在解剖顯微鏡下，仔細(xì)地去除嗅球，隔膜，丘腦和下丘腦，然后剝離硬膜和脈絡(luò)叢，并將大腦皮層下的海馬組織取出到預(yù)冷的無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。用眼科剪將海馬組織切成小塊，然后加入0.25%胰蛋白酶/ 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)并在37℃下消化5 min，以制備單細(xì)胞懸液。離心除去上清后，將細(xì)胞沉淀懸浮于DMEM完全培養(yǎng)基(含2%B27，1%谷氨酰胺，10%胎牛血清)中，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，貼壁6～8 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Neurobasal培養(yǎng)基(現(xiàn)用現(xiàn)配，含有2%B27，1%谷氨酰胺和100 IU/ ml青霉素)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、1 μmol/L DEX處理組、5 μmol/L DEX處理組和50 μmol/L DEX處理組，各組加入不同劑量DEX(1 μmol/L 、5 μmol/L 、50 μmol/L)，分別于處理 2、4、6、8和10 d后檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性，于處理10 d后檢測(cè)細(xì)胞的凋亡、SYN和PSD95的 mRNA表達(dá)以及BDNF-TrkB信號(hào)通路中信號(hào)分子表達(dá)情況。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性

將大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度104個(gè)/孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔(對(duì)照組、1 μmol/L DEX處理組、5 μmol/L DEX處理組、50 μmol/L DEX處理組)，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁后，各組加入不同劑量DEX(1 μmol/L 、5 μmol/L 、50 μmol/L)處理，于DEX處理 2、4、6、8和10 d后，分別加入CCK8溶液混合，避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)吸光度。

1.5 q-PCR

DEX處理10 d后，根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，提取后通過(guò)Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)中，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)。引物序列如下：SYN(NM_008596)正向：CGCACCTCGGACAAGTCTC，反向：CCCGAAGG CGAAAATAGCAAA; Dlg4(PSD95，NM_001109752)正向：TCCGGGAGGTGACCCATTC; 反向：TTT CCGGCGCATGACGTAG。 PCR反應(yīng)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，退火溫度根據(jù)引物的解鏈溫度，反應(yīng)時(shí)間20 s，72℃延伸30 s 40個(gè)循環(huán)。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，消化接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞生長(zhǎng)良好后，分別給予1 μmol/L、5 μmol/L、50 μmol/L DEX和空白對(duì)照處理10 d。按TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，胞核呈棕褐色者為凋亡細(xì)胞，每張片至少觀察 500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，再取其平均值，得出凋亡指數(shù)。

1.7 免疫印跡

蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中10 min并轉(zhuǎn)移至膜上45～60 min，然后用Tris緩沖液(TBS)漂洗PVDF膜10～15 min，并加入適當(dāng)稀釋的抗體(含1%Tween-20的TBS稀釋的脫脂奶粉)，并且在室溫下孵育2 h。然后將PVDF膜用TBST沖洗3次(每次5～10 min)，并與HRP標(biāo)記的二抗孵育，二抗用含有0.05%脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶10 000)。孵育結(jié)束，用TBST漂洗膜3次，每次5～10 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)熒光化學(xué)發(fā)光成像儀曝光處理，用分析軟件分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白的吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DEX對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的DEX處理組和對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞的活性和凋亡曲線在2～10 d無(wú)顯著性差異(P>0.05, 圖1)。制備載玻片上生長(zhǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞并通過(guò)熒光檢測(cè)和Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示對(duì)照組與處理組之間的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05, 表1)，該結(jié)果表明DEX對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)神經(jīng)毒性。

Fig.1Cell activity was detected by CCK8 assays

GroupCell activitySYN mRNA expressionPSD95 mRNA expressionControl72.2±7.41.001.001 μmol/L DEX75.4±6.71.39±0.041.13±0.035 μmol/L DEX75.8±5.81.41±0.031.16±0.0250 μmol/L DEX78.3±8.34.18±0.56**##3.15±0.09**##

DEX: Dexmedetomidine; SYN: Synaptophysin; PSD95: Postsynaptic density protein 95

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe 1 μmol/L DEX group

2.2 DEX對(duì)SYN和PSD95的 mRNA表達(dá)的影響

通過(guò)q-PCR檢測(cè)SYN和PSD95的mRNA表達(dá)，DEX對(duì)海馬神經(jīng)元發(fā)育的影響。與對(duì)照組相比，1和5 μmol/L DEX處理組的SYN和PSD95 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，用50 μmol/L DEX處理組中，觀察到SYN和PSD95 mRNA表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01, 表1)，該結(jié)果顯示DEX對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)育具有重要作用。

2.3 DEX對(duì)BDNF-TrkB信號(hào)通路中信號(hào)分子表達(dá)的影響

免疫印跡分析用于檢測(cè)DEX對(duì)BDNF、TrkB、N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDA)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平的影響(圖2)。與對(duì)照組相比，50 μmol/L DEX處理組BDNF表達(dá)水平顯著增加，對(duì)照組與處理組之間TrkB蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。p-NMDAR的表達(dá)隨著DEX濃度的增加而增加，與對(duì)照組相比，只有高劑量組差異顯著(表2)，DEX的神經(jīng)保護(hù)作用通過(guò)上調(diào)BDNF的表達(dá)和N-甲基-D-天冬氨酸受體的磷酸化水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。

Fig.2The expressions of BDNF and TrkB in the four groups by the Western blot

GroupBDNF TrkBNMDAR p-NMDARControl0.77±0.030.52±0.020.31±0.010.17±0.021 μmol/L DEX0.79±0.010.58±0.020.34±0.020.25±0.025 μmol/L DEX0.89±0.030.59±0.030.39±0.030.33±0.0350 μmol/L DEX1.55±0.03**##0.61±0.020.37±0.010.72±0.05**##

BDNF: Brain-derived neurotropic factor; TrkB: Tyrosine receptor kinase B; NMDAR: N-methyl-D-aspartate receptor

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe 1 μmol/L DEX group

3 討論

美托咪定是α2腎上腺素受體的激動(dòng)劑，它是左旋美托咪定和右旋的混合物，左旋的美托咪定無(wú)藥理學(xué)作用[9]。右美托咪啶在臨床上用作鎮(zhèn)靜和止痛藥，其對(duì)α2腎上腺素受體的敏感性高于美托咪定[10-11]。右美托咪定具有多種保護(hù)作用，包括心肌保護(hù)、肺組織保護(hù)及神經(jīng)病保護(hù)作用等。武勇等的研究顯示右美托咪定可以減輕高血壓心肌肥厚患者圍術(shù)期心肌損傷，對(duì)心肌具有一定的保護(hù)作用[12]。何金波等[13]研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定通過(guò)抑制TLR4表達(dá)從而對(duì)肺起到保護(hù)作用。為了減少全身麻醉在神經(jīng)系統(tǒng)上的有害影響，氯胺酮和丙泊酚等麻醉藥物可與右美托咪定聯(lián)合用于麻醉，這種方法已成為臨床上的趨勢(shì)。尚宇等[14]研究顯示右美托咪定預(yù)處理可以減少腦缺血/再灌注時(shí)興奮性氨基酸釋放，從而產(chǎn)生對(duì)腦的保護(hù)作用。

本研究通過(guò)新生大鼠海馬神經(jīng)元的分離培養(yǎng)，探討了DEX對(duì)新生大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)育及其參與BDNF-TrkB信號(hào)通路的分子表達(dá)的影響，提供更加詳細(xì)的數(shù)據(jù)支持DEX的臨床應(yīng)用。海馬是腦組織的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和邊界相對(duì)清晰，容易解剖和分離，這些優(yōu)點(diǎn)使其成為神經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的理想組織。突觸特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物如SYN和PSD95直接或間接反映了突觸活動(dòng)，形態(tài)變化和突觸生物學(xué)功能,通過(guò)測(cè)定SYN和PSD95 mRNA的表達(dá)水平來(lái)間接顯示神經(jīng)元發(fā)育狀態(tài)。本研究應(yīng)用不同濃度的DEX處理后，分析新生大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力和凋亡情況。采用q-PCR檢測(cè)SYN和PSD95基因的表達(dá)差異，以探討海馬神經(jīng)元的發(fā)育情況。CCK8和TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的DEX處理后，2～10 d的神經(jīng)元活性和凋亡曲線與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，DEX處理組(1,5和50 μmol/L)與對(duì)照組之間的細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異，這表明DEX本身對(duì)神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有毒性，這與之前研究一致，DEX通過(guò)減少Cx32蛋白水平抑制間隙連接活性來(lái)減少缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。DEX的神經(jīng)保護(hù)作用減弱了異氟醚通過(guò)抗氧化，抗炎和抗細(xì)胞凋亡的特性在衰老的大鼠中誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙[16]。然而，雖然DEX在臨床劑量下具有神經(jīng)保護(hù)作用，但高累積劑量和濃度下可誘導(dǎo)體內(nèi)和體外神經(jīng)細(xì)胞凋亡[17]。

BDNF和TrkB的結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象變化，并進(jìn)一步促進(jìn)下游關(guān)鍵激酶的磷酸化。研究已經(jīng)證明BDNF-TrkB信號(hào)通路能夠激活MEK/ERK，PI3K/Akt和PLC-γ1信號(hào)通路等重要通路[18-19]。本研究分析了DEX對(duì)BDNF-TrkB信號(hào)通路及其與NMDA受體表達(dá)相關(guān)的下游效應(yīng)分子及其磷酸化水平的影響。結(jié)果表明50 μmol/L DEX處理后，BDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。然而在用不同濃度的DEX處理后，各組之間TrkB表達(dá)水平無(wú)顯著差異，TrkB蛋白表達(dá)水平與DEX無(wú)相關(guān)性。不同濃度DEX處理后，p-NMDAR水平呈上升趨勢(shì)，但NMDAR蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果證明DEX在達(dá)到一定劑量(50 μmol/L)可對(duì)海馬神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用，其可能通過(guò)上調(diào)BDNF-TrkB信號(hào)通路中BDNF的表達(dá)和N-甲基-D-天冬氨酸受體的磷酸化水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。