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    酶法催化轉(zhuǎn)化乳酸生產(chǎn)D—丙氨酸

    2019-05-21 04:52:16王勝鋒黃毅廖芬艷曾紅宇許崗
    關(guān)鍵詞:丙氨酸丙酮酸酶法

    王勝鋒 黃毅 廖芬艷 曾紅宇 許崗

    摘 要:該文提出了一種基于酶法轉(zhuǎn)化乳酸制備D-丙氨酸的方法。首先,采用乳酸氧化酶催化氧化乳酸生產(chǎn)丙酮酸,然后利用D-氨基酸脫氫酶將丙酮酸還原成D-丙氨酸,在此過(guò)程中加入D-氨基酸脫氫酶、甲酸脫氫酶和NADP,構(gòu)建了輔酶再生體系。乳酸被氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物過(guò)氧化氫,會(huì)導(dǎo)致丙酮酸的降解,通過(guò)添加過(guò)氧化氫酶除去過(guò)氧化氫。通過(guò)優(yōu)化工藝條件,D-丙氨酸的轉(zhuǎn)化總摩爾收率能達(dá)到64.9 %,產(chǎn)品的ee值達(dá)到99.9 %。該研究制備D-丙氨酸相對(duì)于傳統(tǒng)方法,具有工藝環(huán)保、成本低,質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn),適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

    關(guān)鍵詞:乳酸;乳酸氧化酶;丙酮酸;D-氨基酸脫氫酶;甲酸脫氫酶;D-丙氨酸

    中圖分類號(hào):Q935 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    0 前言

    D-丙氨酸作為一種重要的手性化合物,已經(jīng)在制藥、食品、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。它是生產(chǎn)維生素B6的原料,有鎮(zhèn)痛的作用;還是一種甜味劑,是合成二肽阿力甜的重要原料。同時(shí),它還有抑菌的作用,可用作化妝品的添加劑等。

    常規(guī)D-丙氨酸的生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)周期長(zhǎng)、投資大,且制備的D-丙氨酸光學(xué)純度不高。化學(xué)法主要有不對(duì)稱合成和手性拆分的方法,不對(duì)稱合成需要較為昂貴的催化劑,成本高,不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。手性拆分原料成本高,且有一半的L-丙氨酸需要去除,手性純度難以保證。以5-甲基海因?yàn)榈孜锿ㄟ^(guò)外消旋后,再用海因酶和氨甲酰水解酶制備D-丙氨酸,此方法消旋速度慢,條件苛刻,難以工業(yè)化。

    酶法合成D-丙氨酸工藝以其高效催化、綠色環(huán)保等特點(diǎn)引起了研究者的關(guān)注。最近,朱敦明課題組報(bào)道了采用以α酮酸為底物,利用共固定化的二氨基庚二酸脫氫酶和甲酸脫氫酶制備D-丙氨酸,該方法以NADH為輔酶,催化α酮酸直接轉(zhuǎn)化為D-丙氨酸,產(chǎn)品光學(xué)純度>98 %。該工藝的不足之處是采用酮酸為原料,成本較高。該文針對(duì)該方法的缺點(diǎn)開(kāi)發(fā)了一種酶法制備D-丙氨酸的新方法。采用價(jià)格比丙酮酸低10倍的廉價(jià)材料乳酸為底物,先采用乳酸氧化酶(LOD)催化乳酸制備丙酮酸,然后采用D-氨基酸脫氫酶(DAADH)和NADP(H)轉(zhuǎn)化丙酮酸為D-丙氨酸。中間加入甲酸脫氫酶(PFDH),與DAADH和NADP(H)構(gòu)成了輔酶再生體系,轉(zhuǎn)化過(guò)程如圖1所示。該方法成本較低、產(chǎn)品光學(xué)純度高,適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑和儀器

    試劑:過(guò)氧化氫酶,0.3 Mu/mL,山東泰安信得利生物工程有限公司。固定化LOD,100 U/g,PFDH,30 U/mL,DAADH,114 u/mL,均由湖南福來(lái)格生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。乳酸,含量80 %,河南金丹乳酸科技股份有限公司。其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用的水均為超純水。

    儀器:氧化反應(yīng)器,上海保興。高效液相色譜,Agilent 1100。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮RE-2000A。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 酶催化制備乳酸

    將pH為7.0濃度為6 %的乳酸溶液導(dǎo)入氧化反應(yīng)器中。然后加入一定量的過(guò)氧化氫酶,攪拌0.5 h。取一定量的LOD導(dǎo)入氧化反應(yīng)器中,通入氧氣,開(kāi)啟反應(yīng)。取樣做HPLC分析,當(dāng)乳酸的殘留小于2 mg/mL時(shí),停止攪拌和通氧,反應(yīng)停止,過(guò)濾出反應(yīng)液。

    1.2.2 酶催化制備D-丙氨酸

    在過(guò)濾的丙酮酸溶液中加入2倍丙酮酸摩爾量的甲酸銨,并開(kāi)啟攪拌,調(diào)節(jié)pH到7.0,將一定量的PFDH、DAADH以及NADP加入轉(zhuǎn)化料液中,開(kāi)啟反應(yīng)。取樣做HPLC分析,當(dāng)丙酮酸的殘留小于2 mg/mL時(shí),停止攪拌,反應(yīng)停止,采用5K的超濾膜過(guò)濾出反應(yīng)液。

    1.2.3 結(jié)晶

    上述超濾得到的溶液,加入3 ‰活性炭脫色0.5 h,過(guò)濾后升溫濃縮,濃縮到一定濃度后,倒入玻璃燒杯中,冰浴降溫到5 ℃后,過(guò)濾,干燥,得到D-丙氨酸成品。

    2 結(jié)果和討論

    2.1 過(guò)氧化氫酶加量對(duì)LOD催化收率的影響

    在LOD氧化乳酸生成丙酮酸的過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生H2O2,H2O2會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生不利影響,同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致丙酮酸的降解,通過(guò)在轉(zhuǎn)化體系中加入過(guò)氧化氫酶去除H2O2。該研究考察了過(guò)氧化氫酶加量對(duì)轉(zhuǎn)化收率的影響。其他反應(yīng)條件為:乳酸濃度6 %,LOD投量為6 000 u/mol,反應(yīng)溫度30 ℃,pH 7.0。結(jié)果如圖2所示。

    由圖2可知,當(dāng)過(guò)氧化氫酶濃度達(dá)到0.15 Mu/mol時(shí),轉(zhuǎn)化的收率基本達(dá)到穩(wěn)定值,繼續(xù)提高過(guò)氧化氫酶的濃度,轉(zhuǎn)化的收率基本無(wú)增長(zhǎng),因此選擇最佳的過(guò)氧化氫酶濃度為0.15 Mu/mol。

    2.2 LOD投量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

    該研究考察了酶添加量對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。其他反應(yīng)條件與2.1所述一樣。結(jié)果如圖3所示。

    由圖3可知,當(dāng)LOD的加量越大,轉(zhuǎn)化所需時(shí)間越短。當(dāng)氧化酶投量為12 500 u/mol時(shí),氧化反應(yīng)在2 h內(nèi)基本達(dá)到平衡,此時(shí)的收率僅為40 %。當(dāng)酶的加入量小于8 500 u/mol時(shí),反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間延長(zhǎng)至5 h~6 h,收率也在逐步提高。由于酶的投量越大,反應(yīng)越劇烈,需要的過(guò)氧化氫酶的用量也要增加,綜合考慮轉(zhuǎn)化時(shí)間和酶應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性,酶的投量選擇6 000 u/mol。

    2.3 PFDH和DAADH投量對(duì)轉(zhuǎn)化速度的影響。

    該研究考察了PFDH和DAADH投量對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響,PFDH和DAADH投量以1︰1的比例投入。其他反應(yīng)條件為丙酮酸濃度4 %,NADP投量0.06 g/mol,反應(yīng)溫度為30 ℃,pH為7.0。結(jié)果如圖4所示。

    由圖4可知,當(dāng)PFDH和DAADH加量達(dá)到12 000 u/mol后,反應(yīng)5 h基本達(dá)到平衡,收率≥80 %?;诮?jīng)濟(jì)性的考慮,選擇PFDH和DAADH投酶量為24 000 u/mol。

    2.4 最優(yōu)條件下制備D-丙氨酸的數(shù)據(jù)分析

    在最優(yōu)條件下,乳酸濃度6 %,LOD投量為6 000 u/mol,過(guò)氧化氫酶0.15 Mu/mol;PFDH和DAADH投量為24 000 u/mol以及NADP量為0.06 g/mol,兩步轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖5所示。

    從圖5可以看出,乳酸氧化成丙酮酸的摩爾收率為70.8 %,丙酮酸轉(zhuǎn)化成D-丙氨酸的收率為92.1 %,總收率為65.2 %。

    將轉(zhuǎn)化后的料液進(jìn)行結(jié)晶處理,得到成品,經(jīng)檢測(cè),成品的ee值可達(dá)99.9 %,說(shuō)明該工藝能夠制備出高純度的D-丙氨酸。

    3 結(jié)論

    該文提出了一種兩步酶法催化乳酸制備成高純度的D-丙氨酸的方法,通過(guò)優(yōu)化各酶投加量等條件,在保證工藝經(jīng)濟(jì)性的同時(shí),提高了轉(zhuǎn)化的收率。其中乳酸氧化成丙酮酸的收率達(dá)到70 %,丙酮酸制備成D-丙氨酸的收率達(dá)到80 %,通過(guò)分離結(jié)晶后,制備成了高手性純度的D-丙氨酸,其ee值達(dá)到了99.9 %以上。

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