基于脂質(zhì)體反應(yīng)器的酶納米生物傳感器在敵敵畏快速檢測(cè)中的應(yīng)用

關(guān)樺楠，韓博林，龔德?tīng)?，閻秀?

（1.東北林業(yè)大學(xué) 鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

目前，常規(guī)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)及鑒定方法多依賴(lài)于色譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，如高效液相色譜技術(shù)、氣相色譜技術(shù)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)等[1-4]。此類(lèi)技術(shù)大多需要依托于大型實(shí)驗(yàn)室，且具有設(shè)備成本較高和樣品前處理技術(shù)復(fù)雜等缺陷[5-6]。近年來(lái)，生物傳感器技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于食品、藥品和環(huán)境中有害成分分析檢測(cè)的相關(guān)領(lǐng)域，主要包括光化學(xué)生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器。光化學(xué)生物傳感器中熒光傳感器、比色傳感器和表面等離子體共振傳感器因其操作簡(jiǎn)單且不受極限環(huán)境條件限制而被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[5-8]。相比于光化學(xué)生物傳感器，基于酶催化反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器以其成本低、高靈敏度和高特異性的優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9-13]。針對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的檢測(cè)，多以乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）為核心元件構(gòu)建電化學(xué)酶生物傳感器[14-16]。AChE能夠特異性的催化底物乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，在催化反應(yīng)的過(guò)程中會(huì)引起電子的遷移，可通過(guò)電化學(xué)分析方法進(jìn)行定量；然而，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥可特異性抑制AChE的生物活性產(chǎn)生酶抑制反應(yīng)，進(jìn)而阻礙催化反應(yīng)的進(jìn)行，可通過(guò)捕捉反應(yīng)產(chǎn)物膽堿的氧化峰電流值的衰減來(lái)間接定量體系中的農(nóng)藥殘留濃度[17-19]。盡管AChE生物傳感器具有諸多優(yōu)勢(shì)，但是因其酶穩(wěn)定性差和電信號(hào)傳遞困難等問(wèn)題，使得該類(lèi)型傳感器只能用于大量樣品的初篩[20-22]。

為克服常見(jiàn)膽堿酯酶生物傳感器酶活性差和精確度低的缺陷，本研究首先采用脂質(zhì)體包覆技術(shù)，構(gòu)建酶抑制反應(yīng)的密閉乙酰膽堿酯酶反應(yīng)容器（AChE liposomes bioreactor，ALB），從而有效隔絕外界環(huán)境刺激對(duì)酶催化反應(yīng)的影響；利用穿孔蛋白（Porin）在脂質(zhì)體外層的磷脂層上進(jìn)行隨機(jī)打孔，構(gòu)造出反應(yīng)物進(jìn)出“密閉容器”的孔道，保證電信號(hào)的有效傳遞。此外，選用具有良好生物相容性的半導(dǎo)體材料-納米二氧化硅（SiO2）作為固載ALB的基底材料，以帶有正電荷的殼聚糖（chitosan，CS）作為介質(zhì)修飾工作電極；可在滿(mǎn)足酶反應(yīng)器有效負(fù)載量的基礎(chǔ)上，極大程度地改善電子的傳遞速率，進(jìn)而有效提升此類(lèi)電化學(xué)酶?jìng)鞲衅鞯撵`敏度。該方法可為食品及環(huán)境中農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的改良和實(shí)際應(yīng)用提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AChE（Type C3389，1 000 U/mg）、Porin、氯化硫代乙酰膽堿（ATChCl）、氫化大豆卵磷脂（帶負(fù)電荷） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CS（脫乙酰度85%）、硅酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、鐵氰化鉀國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽固醇、熒光黃染料德國(guó)Merck公司；敵敵畏、吡蟲(chóng)啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟鈴脲標(biāo)準(zhǔn)品 北京恒信生物技術(shù)公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 ALB的制備

精確稱(chēng)取處方量卵磷脂、膽固醇、AChE溶液、熒光黃標(biāo)記液以及吐溫20共同溶于10 mL的二氯甲烷中，所得溶液置于茄形瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37 ℃減壓蒸餾，燒瓶轉(zhuǎn)速200 r/min。待燒瓶中二氯甲烷去除干凈且在燒瓶壁上形成均勻透明的薄膜后，加入5%的葡萄糖溶液5 mL，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)30 min，使薄膜溶脹水和完全。懸浮液過(guò)濾去雜質(zhì)，將濾液置于液氮當(dāng)中1 min，待冷凍完全后迅速放入37 ℃的水浴鍋內(nèi)，待完全融化后再次放入液氮中冷凍，如此凍融一定數(shù)量的循環(huán)次數(shù)。凍融結(jié)束后，室溫馴化10 min，于4 ℃保存待用。

用魚(yú)精蛋白沉淀法分離游離的AChE和ALB。精確吸取0.1 mL脂質(zhì)體懸浮液，加入10 mg/mL的魚(yú)精蛋白液0.1 mL，旋渦振蕩混合均勻，靜置5 min，加入甲醇溶液1 mL混勻，溶脹20 min后，1 000 r/min離心5 min，去上清液。測(cè)定脂質(zhì)體中AChE的含量和活性[8]。

1.3.2 納米二氧化硅的制備

25 ℃條件下，向20 mL硅酸鈉溶液（1 mol/L）中加入0.1 g CTAB，再加入10 mL的無(wú)水乙醇，充分混勻后調(diào)節(jié)pH值范圍為4.5～5.5。伴隨超聲波振蕩輔助（20 kHz），25 ℃反應(yīng)1 h。離心去上清液，將固形物真空干燥，并用馬弗爐煅燒，充分研磨后，加入去離子水，超聲波振蕩分散，獲得納米二氧化硅懸浮液（工作液質(zhì)量濃度50 mg/mL）。

1.3.3 GCE-(ALB/SiO2)n的構(gòu)建

電化學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)定采用CHI660e型電化學(xué)工作站三電極系統(tǒng)完成。其中，鉑電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）為工作電極。采用金相砂紙拋光GCE，隨即在去離子水中超聲波清洗20 min，然后將電極置于強(qiáng)酸混合液（V（HNO3）∶V（HCl）∶V（H2O）=1∶3∶4）中浸泡10 min，最后再在去離子水中超聲波清洗20 min。將預(yù)處理后的GCE浸置于CS溶液（體積分?jǐn)?shù)2%，1%醋酸溶解）中，靜置2 min（恒電位為-3.0 V），使GCE表面吸附有帶有正電荷的CS分子，再用去離子水柔和清洗GCE探頭，用以去除游離的CS；將吹干后的電極浸置于二氧化硅懸浮液（50 mg/mL）中，靜置2 min，清洗后再將電極浸置于CS溶液中，靜置2 min清洗后將電極浸置于ALB分散液（50 mg/mL）中，靜置2 min，清洗備用。此過(guò)程為修飾電極的1 次循環(huán)，即在電極表面吸附有一層二氧化硅和一層ALB，此雙層膜即定義為(ALB/SiO2)1。通過(guò)增加實(shí)驗(yàn)循環(huán)數(shù)，將多個(gè)雙層吸附于電極表面，此類(lèi)型的修飾電極即為GCE-(ALB/SiO2)n。1.3.4 電化學(xué)行為分析

首先，考察用于修飾電極的最適雙層膜數(shù)量，將固定有不同數(shù)量雙層酶膜GCE浸置于10 mL磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2）中，再向反應(yīng)池中緩慢加入1 mL的ATChCl溶液（1 mmol/L），反應(yīng)溫度為37 ℃，采用循環(huán)伏安法測(cè)定不同修飾層數(shù)的GCE對(duì)酶催化底物過(guò)程中的電流響應(yīng)特性，以氧化峰電流值的絕對(duì)值最高為宜。其次，考察電極修飾前后靈敏度的變化，將3 種類(lèi)型的電極分別置于10 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）中，再向反應(yīng)池中緩慢加入1 mL的ATChCl溶液（1 mmol/L），反應(yīng)溫度為37 ℃，采用循環(huán)伏安法測(cè)定并比較電極修飾前后對(duì)酶催化底物過(guò)程中的電流響應(yīng)特性，以氧化峰電流值的絕對(duì)值最高為宜。最后，以敵敵畏作為有機(jī)磷農(nóng)藥的模型，修飾電極為核心元件，構(gòu)建農(nóng)藥殘留生物傳感器檢測(cè)體系。將修飾電極置于10 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）中，添加1 mL不同濃度的敵敵畏工作液，充分混勻后室溫靜置15 min。采用循環(huán)伏安法測(cè)定電流相應(yīng)特征，根據(jù)不同濃度敵敵畏引起的電流變化，繪制抑制率曲線，計(jì)算抑制率與最低檢出限，抑制率計(jì)算公式如下[5]：

式中：L是履帶吸盤(pán)的最高點(diǎn)和最低點(diǎn)的距離；h是清潔機(jī)器人重心到工作平面的距離；G是清潔機(jī)器人的重力(N)；α是光伏面板與水平面的夾角；β是支撐點(diǎn)和幾何重心的連線與工作平面法線的夾角，稱(chēng)為抗傾覆特征角，由清潔機(jī)器人的自身結(jié)構(gòu)確定。

式中：I為抑制率/%；I0為GCE-(ALB/SiO2)n檢測(cè)的氧化峰電流值（農(nóng)藥抑制）；I1為GCE-(ALB/SiO2)n檢測(cè)的氧化峰電流值（無(wú)農(nóng)藥抑制）。

1.3.5 選擇性檢測(cè)

選擇常見(jiàn)農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟鈴脲作為干擾物質(zhì)代表（1 mmol/L（亞硝酸鈉濃度10 倍），50%乙醇溶液溶解），以氧化峰電流值的絕對(duì)值為指標(biāo)，評(píng)估該傳感器檢測(cè)以敵敵畏為模型的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥（0.1 mmol/L）的選擇性。

1.3.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

以黃瓜、小白菜和蘋(píng)果作為實(shí)際被測(cè)樣品。稱(chēng)取適量的新鮮黃瓜、小白菜新鮮葉片和蘋(píng)果，使用保鮮膜封好，4 ℃放置過(guò)夜。使用時(shí)將果蔬切碎，分別稱(chēng)取5 g置于燒杯中，加入10 mL PBS（0.1 mol/L pH 7.0）浸提，測(cè)定時(shí)離心吸取上清液，分別向3 種果蔬上清液中加入不同濃度的敵敵畏。檢測(cè)時(shí)加入底物ATChCl至1 mmol/L，記錄電流響應(yīng)數(shù)值，計(jì)算抑制率，重復(fù)測(cè)定5 次，考察檢測(cè)體系的加標(biāo)回收率，并通過(guò)組內(nèi)偏差和組建偏差分別評(píng)價(jià)傳感器檢測(cè)果蔬樣品中農(nóng)藥殘留的精確度和重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)5 次，利用Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。采用DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALB的表征

圖 1 ALB構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic diagram of ALB

ALB構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。采用脂質(zhì)體納米技術(shù)，構(gòu)建ALB，內(nèi)含AChE和熒光黃指示劑；利用Porin在脂質(zhì)體外層的磷脂分子層上創(chuàng)建孔道，構(gòu)造出反應(yīng)物進(jìn)出的門(mén)戶(hù)；當(dāng)農(nóng)藥加入體系后，會(huì)通過(guò)孔道進(jìn)入到反應(yīng)器內(nèi)部，與AChE的活性結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，從而抑制酶活性；當(dāng)?shù)孜锍霈F(xiàn)時(shí)，喪失活性的AChE無(wú)法催化底物產(chǎn)生電信號(hào)物質(zhì)（膽堿和乙酸），與此同時(shí)，產(chǎn)生的乙酸會(huì)降低反應(yīng)器內(nèi)部的酸堿度，使得熒光黃指示劑顯色（pH＜6.8）。通過(guò)電信號(hào)的改變和顏色變化，可定量定性分析有機(jī)磷農(nóng)藥。

圖 2 ALB的掃描電子顯微鏡圖（A）和激光共聚焦顯微圖（B）Fig. 2 SEM (A) and CLSM (B) images of ALB

由圖2A可知，所制備的AChE的脂質(zhì)體粒徑大小分布均勻，分散性良好；外壁粗糙，沒(méi)有明顯缺陷，彼此擠壓處呈現(xiàn)出一定的形變，此現(xiàn)象充分證明了脂質(zhì)體磷脂層的機(jī)械強(qiáng)度和物理彈性，該結(jié)構(gòu)可有效保持脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，不易溶脹。激光粒度分析結(jié)果表明，ALB的平均粒徑約為（7.26±0.75）μm。為進(jìn)一步確定ALB是否將AChE與熒光指示劑包覆其中，采用激光共聚焦電子顯微鏡進(jìn)行表征。由圖2B可知，可清晰觀察到所制備的ALB具有綠色熒光內(nèi)核，初步證明酶反應(yīng)體系已被成功包覆于脂質(zhì)體中。ALB經(jīng)清洗后，采用甲醇原液溶脹破碎ALB，再測(cè)定AChE活性，可進(jìn)一步確定是否包覆成功。結(jié)果表明，5 組脂質(zhì)體的活性包封率的平均值為89.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%，經(jīng)過(guò)計(jì)算，1 mg的ALB中的平均AChE包覆量約為0.21 mg。采用Porin在ALB的磷脂分子層表層進(jìn)行打孔，構(gòu)建反應(yīng)底物和電信號(hào)物質(zhì)進(jìn)出的孔道。參考預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)之前的研究成果[8]，在本研究的Porin用量下，所產(chǎn)生的孔道可通過(guò)分子質(zhì)量10 000 kDa以下的物質(zhì)，滿(mǎn)足本實(shí)驗(yàn)的要求。通過(guò)Zeta電位儀檢測(cè)，ALB的表面電位為-78.6 mV，表面帶有負(fù)電荷。

2.2 最適(ALB/SiO2)n酶膜層數(shù)的篩選

本環(huán)節(jié)實(shí)驗(yàn)中，分別設(shè)定酶膜層數(shù)n值為1～10 個(gè)雙層，即制備體系1～10 個(gè)循環(huán)。以不同層數(shù)酶膜修飾電極所響應(yīng)的氧化峰電流值的絕對(duì)值為評(píng)估指標(biāo)，確定最適酶膜層數(shù)。由圖3可知，當(dāng)n值在1～5范圍內(nèi)時(shí)，氧化峰電流的響應(yīng)峰值的絕對(duì)值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)；當(dāng)n為6時(shí)，峰電流值的絕對(duì)值也達(dá)到了最大值為16.8 μA；當(dāng)n在7～10之間時(shí)，峰電流值的絕對(duì)值逐漸下降，說(shuō)明修飾電極的酶膜所固載的ALB達(dá)到飽和階段，催化固定量底物時(shí)已無(wú)產(chǎn)生更多的電信號(hào)[23-25]。綜上所述，確定n為6，即所構(gòu)建的傳感器核心電極為GCE-(ALB/SiO2)6。

圖 3 不同層數(shù)酶膜修飾電極的最大響應(yīng)電流Fig. 3 Effect of number of layers of enzyme-loaded films on maximum response current of modified electrode

2.3 納米多層酶膜的表征

為觀察多層酶膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)，采用金屬針對(duì)酶膜進(jìn)行打孔處理。由圖4A可知，ALB微球與納米二氧化硅通過(guò)層層自組裝過(guò)程而逐層吸附排列。通過(guò)表層的ALB微球分布可以了解到，ALB牢固鑲嵌在納米二氧化硅層中，這種分布保證了多層酶膜的機(jī)械穩(wěn)定性，不易出現(xiàn)溶脹斷層和修飾電極時(shí)的基底效應(yīng)[21]。

圖 4 多層酶膜的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 SEM micrographs of enzyme-loaded films

2.4 GCE-(ALB/SiO2)6的電化學(xué)行為分析

選用3 種電極（裸電極、無(wú)二氧化硅修飾電極和多層酶納米膜修飾電極）的循環(huán)伏安曲線進(jìn)行比較研究，評(píng)估修飾前后電極性能的改變。由圖5可知，當(dāng)?shù)孜顰TChCl沒(méi)有加入到反應(yīng)體系時(shí)，3 種類(lèi)型的工作電極都沒(méi)有產(chǎn)生明顯氧化還原峰，說(shuō)明沒(méi)有產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)，體系中未發(fā)生酶催化反應(yīng)（圖5曲線a～c）。而當(dāng)添加底物溶液時(shí)（1 mmol/L），圖5曲線e～f 3 種類(lèi)型的工作電極的特征氧化峰顯著增加，表明體系中發(fā)生了酶催化反應(yīng)，造成了電子的遷移，電信號(hào)開(kāi)始進(jìn)行傳遞。酶膜的修飾的電極（圖5曲線d和f）的氧化峰電流的絕對(duì)值明顯高于裸電極（圖5曲線e），說(shuō)明采用酶膜修飾電極的電化學(xué)性能較優(yōu)。其中，圖5曲線f具有最高的氧化峰電流值的絕對(duì)值，說(shuō)明GCE-(ALB/SiO2)6具有最好的電化學(xué)響應(yīng)性能，也同時(shí)說(shuō)明了酶膜中的納米氧化硅可以極大程度地提高整個(gè)修飾電極的電化學(xué)響應(yīng)性能，增強(qiáng)電子的離穴傳導(dǎo)性，這與其他的研究結(jié)果相似[13]。

圖 5 裸GCE、GCE-(CS/ALB)5和GCE-(ALB/SiO2)6電化學(xué)行為Fig. 5 Cyclic voltammograms of bare GCE, GCE-(CS/ALB)5 and GCE-(ALB/SiO2)6

2.5 GCE-(ALB/SiO2)6對(duì)農(nóng)藥的響應(yīng)

有機(jī)磷農(nóng)藥可特異性抑制ALB中AChE的活性，阻礙其催化底物ATChCl，產(chǎn)生電信號(hào)。當(dāng)?shù)孜餄舛裙潭〞r(shí)，伴隨著農(nóng)藥添加量的提高，體系的氧化峰電流數(shù)值的絕對(duì)值會(huì)隨之下降，進(jìn)而判斷體系中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留[26-28]。本環(huán)節(jié)實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)伏安法評(píng)估構(gòu)建的GCE-(ALB/SiO2)6修飾電極對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏的快速響應(yīng)。如圖6所示，由于AChE的催化活性被敵敵畏抑制，導(dǎo)致峰電流值的絕對(duì)值下降。當(dāng)農(nóng)藥殘留濃度由10-5mol/L下調(diào)至10-12mol/L時(shí)，峰電流絕對(duì)值由11.7 μA提升至16.7 μA。農(nóng)藥殘留濃度在10-10～10-12mol/L區(qū)間內(nèi)，峰電流變化趨于平緩，說(shuō)明修飾電極中酶抑制反應(yīng)已非常微弱，電信號(hào)輸出達(dá)到飽和值。

圖 6 修飾電極對(duì)不同濃度敵敵畏的響應(yīng)Fig. 6 Effect of different concentrations of dichlorvos on response current of electrode

圖 7 抑制率擬合曲線Fig. 7 Fitted curves for dichlorvos inhibition

由圖7可知，敵敵畏濃度與抑制率在兩個(gè)濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，這與其他研究類(lèi)似[19,21,24]。在敵敵畏濃度在0.25～1.75 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，抑制率回歸方程為I=28.58C+5.35，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 7。在2～10 μmol/L的范圍內(nèi)抑制率回歸方程為I=2.38C+51.25，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。根據(jù)工作曲線方程計(jì)算（3s/b）檢出限為（0.72±0.065）μg/L，遠(yuǎn)低于飲用水國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)的10 μg/L有機(jī)磷農(nóng)藥最大殘留量。根據(jù)本研究中傳感器所獲得的檢出限，與其他基于AChE生物傳感器的研究作比較，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，本研究的傳感器最低檢出限為（0.72±0.065）μg/L（3×10-10mol/L），與其他研究中檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥相比具有相對(duì)較低的檢出限，說(shuō)明該類(lèi)型生物傳感器具有良好的靈敏度。

表 1 GCE-(ALB/SiO2)6與其他基于AChE的生物傳感器檢測(cè)農(nóng)藥的性能對(duì)比Table 1 Comparison of GCE-(ALB/SiO2)6 and other biosensors based on immobilized AChE used for detection of pesticides

2.6 GCE-(ALB/SiO2)6的檢測(cè)選擇性

選擇4 種常見(jiàn)的非有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，分別是吡蟲(chóng)啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟鈴脲參與此傳感器的選擇性研究。在傳感檢測(cè)體系中分別添加4 種農(nóng)藥的工作液，使其終濃度分別為1 mmol/L，高于敵敵畏10 倍，以雙蒸水代替農(nóng)藥作空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果表明，空白對(duì)照的峰電流值的絕對(duì)值為23.8 μA，這是在ALB中AChE完全沒(méi)有受到抑制的情況下催化底物產(chǎn)生的電流響應(yīng)；與此同時(shí)，吡蟲(chóng)啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟鈴脲4 種農(nóng)藥分別產(chǎn)生的峰電流值的絕對(duì)值與空白對(duì)照非常接近，說(shuō)明4 種農(nóng)藥都沒(méi)有對(duì)AChE產(chǎn)生明顯抑制；敵敵畏的檢測(cè)過(guò)程中峰電流的絕對(duì)值只有14.5 μA，同時(shí)說(shuō)明了該體系對(duì)敵敵畏所代表的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥具有檢測(cè)的特異性。

圖 8 GCE-(ALB/SiO2)6選擇性檢測(cè)敵敵畏Fig. 8 Selectivity of GCE-(ALB/SiO2)6 toward dichlorvos versus other tested pesticides

2.7 GCE-(ALB/SiO2)6檢測(cè)實(shí)際樣品

在果蔬樣品的PBS浸提液中，加入敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)液，使得體系中的農(nóng)藥質(zhì)量濃度分別為0.1、0.25 μg/mL和0.5 μg/mL。采用制備好的酶生物傳感器檢測(cè)果蔬中農(nóng)藥的殘留，用以確定傳感器對(duì)果蔬樣品中不同濃度敵敵畏的加標(biāo)回收率和精密度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定5 次，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率在94%～105%之間，且組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差皆在5%以下，符合檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)（12%以下），說(shuō)明該傳感檢測(cè)體系具有良好的加標(biāo)回收率和精密度。

表 2 GCE-(ALB/SiO2)6檢測(cè)樣品中不同濃度敵敵畏的回收率和精密度Table 2 Recovery and precision (RSD) of GCE-(ALB/SiO2)6 for different concentrations of dichlorvos

根據(jù)敵敵畏檢測(cè)工作曲線，分別測(cè)定質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.1、0.25 μg/mL和0.5 μg/mL的敵敵畏在果蔬中的殘留。根據(jù)5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電流響應(yīng)數(shù)值，通過(guò)組間標(biāo)準(zhǔn)偏差，衡量此類(lèi)傳感器在檢測(cè)果蔬樣品中敵敵畏殘留的重復(fù)性。由表3可知，組間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%～4%之間，說(shuō)明GCE-(ALB/SiO2)6在檢測(cè)敵敵畏殘留的過(guò)程中具有良好的重復(fù)性。

表 3 GCE-(ALB/SiO2)6檢測(cè)樣品中不同濃度敵敵畏的重復(fù)性Table 3 Repeatability of GCE-(ALB/SiO2)6 for different concentrations of dichlorvos

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)旨在建立快速檢測(cè)果蔬中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的電化學(xué)型酶納米生物傳感器。本研究發(fā)現(xiàn)，所制備的ALB微結(jié)構(gòu)表面沒(méi)有明顯缺陷，活性包封率達(dá)到89.5%，并能夠有效保持內(nèi)環(huán)境中AChE活性；利用層層自組裝技術(shù)所構(gòu)建的GCE-(ALB/SiO2)6相比于GCE-(CS/ALB)5具有更加優(yōu)越的檢測(cè)靈敏度，進(jìn)一步說(shuō)明了納米氧化硅作為固載材料時(shí)的良好性能；在檢測(cè)實(shí)際樣品的過(guò)程中，GCE-(ALB/SiO2)6針對(duì)敵敵畏的殘留體現(xiàn)出良好的靈敏度、精確度、選擇性和重復(fù)性。本研究將為食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的改進(jìn)積累基礎(chǔ)資料。