基于噬菌體展示納米抗體的綠色免疫PCR檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

江東健，羅秀兒，何慶華,*

（1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330031）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是一種常見的真菌次級代謝產(chǎn)物，主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產(chǎn)生[1]，此外還有尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、串珠鐮刀菌（F. moniliforme）、擬枝孢鐮刀菌（F. sporotricoides）、粉紅鐮刀菌（F. roseum）和雪腐鐮刀菌（F. nivale）等亦可產(chǎn)生，DON廣泛存在于大麥、小麥、玉米、燕麥等作物中，是一種全球性污染的真菌毒素[2-3]。

目前，檢測DON的主要方法有薄層層析法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、膠體金免疫層析法[6]、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[7-9]等。其中ELISA法是目前較為常用的真菌毒素檢測方法，該方法是在抗原抗體免疫學反應特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上，利用酶的高效催化作用以放大信號實現(xiàn)檢測，具有操作簡便、特異性強和靈敏度高等優(yōu)點。然而，傳統(tǒng)的真菌毒素免疫分析體系大多基于競爭型模式，制備真菌毒素全抗原（包被抗原或競爭抗原）是建立競爭型免疫分析方法的前提和關(guān)鍵。目前，傳統(tǒng)的真菌毒素全抗原需以標準品為原料，通過化學合成的方式，與大分子蛋白偶聯(lián)制備而成，存在制備成本高、批次誤差大且對環(huán)境具有毒害作用等缺陷。

有鑒于此，尋求制備真菌毒素全抗原替代物用于免疫學分析的測定已成為當前研究的熱點。近些年來，噬菌體展示技術(shù)在真菌毒素替代物上提供了一個新的思路。該技術(shù)是將外源編碼蛋白的基因插入到噬菌體衣殼蛋白基因中，然后同衣殼蛋白進行融合表達，從而實現(xiàn)展示外源蛋白的目的[10]。由此，可以通過生物親和淘選得到能和靶物質(zhì)特異性結(jié)合的噬菌體，而且噬菌體具有快速大批量的生產(chǎn)等優(yōu)點。Xu Yang等[11-12]將橘霉素（citrinin，CIT）特異性單克隆抗體作為靶標，從天然羊駝抗體庫及天然駱駝抗體庫分別淘選得到CIT的噬菌體展示抗獨特型納米抗體，替代傳統(tǒng)的CIT化學合成抗原應用于免疫學分析體系，實現(xiàn)CIT的綠色免疫分析。Wang Xianxian等[13]將玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）特異性單克隆抗體作為靶標，從天然羊駝噬菌體展示納米抗體文庫淘選得到ZEN的噬菌體展示抗獨特型納米抗體，實現(xiàn)了免疫學分析ZEN的無毒檢測。Ji Yanwei等[14]將赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）特異性單克隆抗體作為靶標，從駝源天然納米抗體文庫淘選得到OTA的噬菌體展示抗獨特型納米抗體，替代傳統(tǒng)的OTA人工合成抗原，建立OTA環(huán)境友好型的免疫檢測方法。He Zhenyun等[15]將OTA特異性單克隆抗體作為靶標，從噬菌體展示隨機十二肽庫和環(huán)七肽庫淘選得到7 株OTA的噬菌體展示模擬表位，替代傳統(tǒng)的OTA人工抗原，實現(xiàn)了OTA的無毒免疫分析。He Qinghua等[16]將ZEN特異性單克隆抗體作為靶標，從噬菌體展示十二肽庫淘選得到5 株ZEN的噬菌體展示抗原模擬表位，很好地應用于ZEN的綠色免疫學分析。此外，Shu Mei[17]和Wang Yanru[18]等分別得到了伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）和黃曲霉毒素B（aflatoxin，AFB）的抗獨特型抗體?？躬毺匦涂贵w可以模擬抗原的結(jié)合位點，同時又與天然抗原競爭，可以作為良好的抗原模擬物用于免疫學分析。

熒光定量免疫聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法是20世紀90年代被開發(fā)出來的一項技術(shù)，該方法結(jié)合了抗原抗體免疫學反應強特異性和PCR高擴增的敏感性，一定程度上彌補了ELISA方法不適用于小分子、示蹤物質(zhì)及低濃度樣本的定量檢測。Sano等[19]在1992年建立了一種新型的檢測技術(shù)即免疫PCR，該方法是將特異性抗體和核酸分子偶聯(lián)，用核酸作為標記物進行PCR擴增以達到放大信號的目的。由于PCR的超高擴增效率使得該方法的靈敏度有幾個數(shù)量級的提升，很大程度上解決了很多物質(zhì)的微量檢測問題[20-22]。然而，該類方法由于需要特異性抗體和核酸分子的偶聯(lián)過程，不僅操作耗時、繁瑣，而且破壞了抗體及DNA的活性。近年來，研究者們開發(fā)出一種新型的噬菌體展示-免疫PCR方法，利用噬菌體展示技術(shù)將特異性抗體和其核酸序列直接聯(lián)系在一起，可直接進行PCR擴增，省去了特異性抗體和核酸分子偶聯(lián)的繁瑣過程。Liu Yuanyuan等[23]基于抗Cry1Ac噬菌體展示納米抗體建立的定量免疫PCR檢測Cry1Ac方法，最低檢出限為0.1 pg/mL。Lei Jiawen等[24]基于抗AFB的噬菌體展示抗獨特型納米抗體建立定量免疫PCR檢測谷物和飼料中的AFB，最低檢出限為0.02 ng/mL。抗獨特型納米抗體作為無毒試劑的替代和PCR的高擴增敏感的信號放大作用可以使檢測的安全性和靈敏度大大提高。目前，應用該方法進行DON檢測的文獻鮮見報道。

本實驗室在前期工作中，已從駝源天然納米抗體庫中淘選出1 株鼠源DON單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體展示抗獨特型納米抗體[25]。該噬菌體顆粒既可以作為檢測抗原用于免疫學分析，同時噬菌體顆粒內(nèi)包裹的DNA又可以作為DNA模板進行PCR擴增。基于這個原理（圖1），本研究根據(jù)鼠源DON單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體展示抗獨特型抗體，建立一種基于噬菌體展示納米抗體的高靈敏、特異性檢測DON的免疫熒光定量PCR方法。該方法直接使用噬菌體展示抗獨特型納米抗體作為競爭抗原的替代物，應用于免疫PCR體系，避免了使用傳統(tǒng)的化學合成酶標抗原所帶來的環(huán)境污染、操作毒性等缺陷，在食品安全尤其是在真菌毒素、致病菌[26]、農(nóng)藥殘留[27]、轉(zhuǎn)基因食品以及腫瘤標記物[28-29]的綠色靈敏檢測方面具有廣泛的應用前景。

圖 1 基于噬菌體展示納米抗體的定量免疫PCR原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of phage displayed nanobody based real-time immuno-PCR

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DL2000 DNA Marker、SYBR熒光定量PCR試劑盒日本TaKaRa公司；Goldview核酸染料 北京索萊寶科技有限公司；抗DON單克隆抗體、抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體（P-28）由本實驗室自制；DON標準品美國Sigma公司；HRP酶標記的抗M13二抗 美國GE Healthcare公司；E.coli TG1由本實驗室保存；BSA、OVA 生工生物工程（上海）有限公司；96 孔聚丙烯PCR板 美國ABI公司；20% PEG/NaCl溶液（141.1 g NaCl+200 g PEG8000，去離子水定容至1 L）；0.1 mol/L Gly-HCl溶液（0.75 g甘氨酸+2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2.2，去離子水定容至100 mL）；2 mol/L Tris-HCl溶液（48.44 g Tris+HCl調(diào)節(jié)pH 8.5，去離子水定容至200 mL）；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（KH2PO40.27 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，5 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 7.4，加超純水定容至1 L）；0.05% PBST（1 L 0.01 mol/L PBS+0.5 mL Tween-20）；TMB顯色液；2 mol/L H2SO4終止液（10 mL 98%的H2SO4+80 mL超純水）；LB培養(yǎng)基（5 g酵母提取物，10 g細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，10 g NaCl定容至1 L超純水）；LB/Amp平板（LB培養(yǎng)基+15 g/mL瓊脂粉+0.1 mmol/L Amp）；Bind/Wash Buffer（20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0，真空抽濾）；Elution Buffer（0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5，真空抽濾）；中和Buffer（1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5，真空抽濾）。

1.2 儀器與設(shè)備

ECO0.9型超凈工作臺 美國Thermo公司；微量移液器 芬蘭Labsystems公司；HQL150B大幅度恒溫搖床上海智城分析儀器制造有限公司；CFX96 realtime PCR儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 抗DON單克隆抗體的純化

取出Protein G親和層析柱，豎直固定上樣管于鐵架臺，關(guān)閉活塞；預先加入1 mL的Bind/Wash Buffer至層析柱中，充分搖勻，加入1 mL的勻漿，靜置15～30 min。加入5 mL Bind/Wash Buffer到柱中，流速約為1 mL/min，流凈后關(guān)閉活塞，加入用Bind/Wash Buffer 1∶1稀釋的DON單克隆抗體腹水，室溫靜置30 min，流速約為1 mL/min，收集流穿液。加入30 mL Bind/Wash Buffer，流速約為2 mL/min，收集洗滌液，洗雜后，加入10 mL Elution Buffer流速約為1 mL/min，收集洗脫液，然后用1/10體積的中和Buffer調(diào)節(jié)pH 7.4。加入10 mL Bind/Wash Buffer洗滌柱子，關(guān)閉活塞，加入10 mL含20%乙醇溶液的Bind/Wash Buffer，4 ℃保存。

1.3.2 抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體（P-28）的擴增

P-28劃線于LB/Amp平板培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種于5 mL LB/Amp培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)6 h。1%的接種量接種于25 mL LB/Amp培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD值0.35～0.5左右；加入輔助噬菌體 M13KO7（感染復數(shù)1∶1），37 ℃靜置孵育15 min后轉(zhuǎn)至搖床，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)45～60 min。培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，25 mL LB/Amp/Kana培養(yǎng)基重懸菌體，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1/5體積的PEG/NaCl，冰上靜置4 h以上；菌液在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用1 mL 1×PBS懸浮噬菌體，加入1/5體積的PEG/NaCl ，冰上孵育1 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，250 μL 1×PBS重懸噬菌體并測滴度。

1.3.3 引物設(shè)計

根據(jù)抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28的VHH片段FR3-CDR3區(qū)序列設(shè)計引物，并由南京金斯瑞公司合成。引物序列如下：P28-F 5’-3’ ACT ATA TAG ACT CCG TGA AGG G（22 bp）；P28-R 5’-3’ AGC ACT ATA AGG TAC TGT CGA AC（23 bp）。

1.3.4 引物驗證

將合成的引物擴增抗DON單抗的噬菌體陽性克隆，以P-28為模板進行普通PCR。反應體系如下：10×PCR buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，Mg2+1.2 μL，P28-F 0.5 μL，P28-R 0.5 μL，模板0.5 μL，Taq酶0.15 μL，ddH2O 13.55 μL，反應體系共計20 μL。PCR條件如下： 95 ℃變性10 min；退火、延伸（95 ℃、1 min，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s）×30；72 ℃、10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外成像儀下觀察結(jié)果并拍照。1.3.5 PCR退火溫度的優(yōu)化

以P-28噬菌體為模板，P28-F、P28-R為特異性引物，進行定量PCR，實驗共設(shè)計88 孔，各行設(shè)置梯度退火溫度：55～65 ℃；各列設(shè)置梯度噬菌體數(shù)量1010、109、108、107、106、0，定量PCR體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，P28-F（10 μmol/L）0.5 μL，P28-R（10 μmol/L）0.5 μL，P-28噬菌體6 μL，ddH2O 3 μL，反應體系共計20 μL。PCR條件：變性95 ℃、10 min；退火95 ℃、30 s，55～65 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40 個循環(huán)；循壞后添加溶解曲線。

1.3.6 定量PCR檢測DON方法的建立

用抗DON的單克隆抗體（10 μg/mL）包被96 孔酶標板，4 ℃孵育過夜，PBST洗板4 次，加入300 μL/孔4%的脫脂牛奶-PBS封閉，37 ℃孵育2 h，PBST洗板4 次。加入50 μL梯度質(zhì)量濃度的DON標品（1 000、100、10、1、0.1、0 ng/mL）/待測樣品和50 μL P-28（1∶3 200），PBST洗板4 次，加入100 μL 0.1 mol/L Gly-HCl（pH 2.2），水平搖床振蕩孵育10 min后用移液器吸出，加入10 μL 2 mol Tris-HCl進行中和，移液器吹打數(shù)次混勻，取6 μL中和液進行定量PCR。定量PCR體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL、P28F（10 μmol） 0.5 μL、P28R（10 μmol） 0.5 μL、P-28噬菌體6 μL、加超純水至20 μL。定量PCR條件：變性95 ℃、10 min；退火95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40 個循環(huán)；循環(huán)后添加溶解曲線。

1.3.7 加標回收實驗

準確稱取1 g空白玉米樣品，分別加入1、10、100、1 000 μg/kg的DON，然后加入10 mL PBS提取液，置于渦旋振蕩器上充分振蕩15 min，8 000 r/min離心20 min，收集上清液，按1.3.6節(jié)所述方法進行DON含量的測定，計算加標回收率及變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗DON單克隆抗體的純化

固相親和淘選是以純度高的抗DON單克隆抗體作為靶體，得到與之特異性結(jié)合并能與DON標準品競爭結(jié)合抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28，因此純度較高的抗DON單克隆抗體與噬菌體展示納米抗體P-28結(jié)合活性較好。故本實驗采用金斯瑞Protein G親和層析柱法對抗DON單克隆抗體腹水進行純化，純化后抗體的SDS-PAGE分析如圖2所示，在洗脫液中55 kDa和25 kDa處各有一條清晰的條帶，分別為抗DON單克隆抗體的重鏈與輕鏈?？笵ON單克隆抗體的純度較高。

圖 2 免疫親和層析柱法純化的抗DON單克隆抗體的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of anti-DON monoclonal antibodies purified by immuno-affinity chromatography

2.2 引物的驗證結(jié)果

P-28是基于噬菌體展示文庫淘選出來的抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體，為建立DON的熒光定量PCR檢測方法，依據(jù)P-28 VHH編碼基因FR3-CDR3區(qū)設(shè)計PCR引物。利用普通PCR方法對引物進行驗證，將rTaq酶擴增后的反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，結(jié)果如圖3所示，獲得目的條帶為149 bp，成功擴增出目的序列，表明該引物可以進行熒光定量PCR的后續(xù)實驗。

圖 3 噬菌體展示納米抗體P-28 VHH編碼基因FR3-CDR3區(qū)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 3 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR amplified FR3-CDR3 region of the VHH encoding gen of phage displayed nanobody P-28

2.3 定量PCR退火溫度的優(yōu)化

采用梯度PCR的方法，設(shè)置模板數(shù)梯度（106、107、108、109、1010PFU/mL）和退火溫度梯度（55～65 ℃），配制PCR體系后進行擴增。結(jié)果表明，定量PCR特異性良好，熔點曲線只存在單一峰（圖4）。P-28噬菌體定量PCR擴增曲線如圖5所示，作出每個退火溫度下，模板數(shù)的對數(shù)（X）與Ct值（Y）的相關(guān)性曲線，如表1所示，起始模板數(shù)越多，Ct越小，并且每個模板的Ct值與模板數(shù)的對數(shù)值存在線性關(guān)系。對比不同退火溫度下的相關(guān)系數(shù)R2和擴增效率，當退火溫度65 ℃時，R2為1且擴增效率達96.33%，表明在退火溫度65 ℃條件下，PCR的穩(wěn)定性和重復性較好。因此，在后續(xù)實驗中，退火溫度均設(shè)為65 ℃。

圖 4 P-28噬菌體定量PCR熔點曲線峰圖Fig. 4 qPCR melting point curve for P-28 phage

圖 5 不同退火溫度下噬菌體模板的定量PCR擴增曲線圖Fig. 5 qPCR amplification curves of phage template at different annealing temperatures

表 1 不同退火溫度下噬菌體模板數(shù)與Ct值的線性方程Table 1 Standard curves of phage template at different annealing temperatures

2.4 定量PCR檢測DON方法的建立

基于抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28，建立基于間接競爭的定量免疫PCR檢測DON的方法。本研究通過方正滴定方法確定最佳DON單克隆抗體包被質(zhì)量濃度為10 μg/mL，噬菌體的稀釋倍數(shù)為1∶3 200，抗原、抗體的反應時間為1 h。再在此條件下建立免疫熒光PCR檢測DON的標準曲線，基于噬菌體展示納米抗體P-28定量PCR檢測DON的擴增曲線如圖6所示，然后以DON標準品質(zhì)量濃度對數(shù)值（x）為橫坐標、Ct值（y）為縱坐標繪制標準曲線，線性方程為y=24.11+0.51x，相關(guān)系數(shù)R為0.995。

圖 6 基于噬菌體展示納米抗體定量PCR檢測DON的擴增曲線圖Fig. 6 Amplification curves for qPCR detection of DON based on phage displayed nanobody

本研究建立的免疫熒光PCR方法的線性范圍為0.1～1 000 ng/mL，IC50值為（3.96±2.21）ng/mL，最低檢出限為0.048 ng/mL，擬合曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.996，組間誤差、批間誤差、日間誤差分別為4.2%、6.2%、8.9%（n=3）。采用間接競爭ELISA測定P-28的特異性，加入其他4 種常見的真菌毒素FB1、ZEN、AFB1和OTA，進行間接競爭分析，P-28與其他4 種真菌毒素均無明顯交叉反應，表明該方法對DON定量檢測特異性良好。

2.5 加標回收率驗證結(jié)果

為驗證所開發(fā)方法的可靠性，本實驗向陰性的玉米樣品中添加不同質(zhì)量濃度的DON標準品，經(jīng)PBS提取后，進行定量免疫PCR分析，結(jié)果如表2所示，該方法用于檢測DON的加標回收率為90.7%～108.3%，變異系數(shù)為7.22%～13.89%，表明該方法具有良好的準確性及重復性。

表 2 基于噬菌體展示納米抗體的綠色免疫PCR分析DON的加標回收實驗Table 2 Recovery of DON from spiked corn by phage displayed nanobody-mediated green immuno-PCR

3 討 論

噬菌體展示-免疫PCR方法采用噬菌體粒子作為檢測抗原或者抗體，同時也提供在噬菌體展示-免疫PCR擴增過程中的DNA模板。由于熒光染料的存在，隨著PCR的進行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，熒光染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合使得熒光信號以指數(shù)形式不斷放大，這一信號放大過程使得此方法的靈敏度和線性范圍得到了顯著改善。

本研究針對噬菌體展示納米抗體技術(shù)淘選出來的抗DON單抗的噬菌體展示抗獨特型納米抗體P-28，建立了一種高靈敏、特異性檢測DON的熒光定量PCR的檢測方法，IC50值為從傳統(tǒng)的噬菌體ELISA值（77.89±1.77）ng/mL[25]降低至（3.96±2.21）ng/mL，最低檢出限為0.048 ng/mL，線性范圍從21.14～316.52 ng/mL[25]擴寬到0.1～1 000 ng/mL。相比于傳統(tǒng)phage-ELISA檢測方法，此方法提高了DON的檢測靈敏度及檢測范圍。同時，本研究將抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28用于替代小分子抗原用于免疫學檢測，降低了因引入DON標準品制備全抗原對人體的毒害和環(huán)境的污染，提高了產(chǎn)品的應用價值[30]，因此在食品安全尤其是真菌毒素檢測領(lǐng)域的應用具有廣泛的應用前景。