響應(yīng)面法優(yōu)化酶解低溫榨取漢麻籽油工藝

王 雯，王睿智，王 彤，王立琦，朱秀清,*，石彥國(guó),*，于殿宇

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，谷物食品與谷物資源綜合加工省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150065；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150038）

漢麻籽也稱火麻籽[1]，其主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，微量營(yíng)養(yǎng)元素Ca、K、Mg、Mn等含量也較為豐富[2-3]。漢麻籽呈卵圓形微扁，因品種而不同[4]。漢麻籽仁脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%～50%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～40%，膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～40%[5-6]。漢麻籽油作為食品和天然保健用品的原料，具有活血通潤(rùn)的效果[7-8]，對(duì)于免疫系統(tǒng)具有很好的藥理作用[9]。用于食品開(kāi)發(fā)的漢麻籽中Δ9-四氫大麻酚含量通常低于10 μg/g（以種子計(jì)）[10-11]。

目前，漢麻籽油的提取方法主要有溶劑萃取法、熱榨法及冷榨法、超聲輔助提取法等[12-14]，這些方法雖然技術(shù)成熟，利于工業(yè)化生產(chǎn)，但存在不容忽視的問(wèn)題[15-16]。溶劑萃取法提取油脂會(huì)造成一定的溶劑殘留，需要在較高溫度下才能脫除。熱榨法需要在高溫下進(jìn)行預(yù)處理調(diào)質(zhì)，高溫下進(jìn)行壓榨[17]。漢麻籽油中有80%以上的多不飽和脂肪酸，高溫易導(dǎo)致漢麻油過(guò)氧化值升高，很多天然營(yíng)養(yǎng)成分被破壞，不但降低了原有的生物活性，而且降低了生物利用度[18-19]。低溫冷榨制油法屬于壓榨法的一種，是指油料作物在入榨前不經(jīng)過(guò)蒸炒等高溫處理，入榨溫度較低的榨油方法[20-21]。低溫冷榨法制得油脂的天然成分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失少，避免了熱榨法高溫處理帶來(lái)的不利影響[22-23]。在較低溫度下對(duì)漢麻籽進(jìn)行壓榨提取油脂，最大限度地保持了漢麻籽油的天然組分和結(jié)構(gòu)[24-25]，但出油效率較低，資源利用度不高。

本研究在國(guó)內(nèi)外大量相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以漢麻籽仁為原料，在低溫條件下進(jìn)行初榨，得到部分功能性較好的初榨油，由于初榨溫度較低，餅中殘油較高，因此嘗試在初榨餅中加入Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，再進(jìn)行低溫復(fù)榨，榨取初榨餅中剩余部分油脂，以獲得更高的出油效率，同時(shí)期望漢麻籽油理化指標(biāo)穩(wěn)定，油中功能性成分仍保留完全，為研究酶解低溫榨取漢麻籽油提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻籽（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)40.2%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)30.6%，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.7%） 黑河市格潤(rùn)公司；Viscozyme L植物水解酶、Protex 6L堿性蛋白酶 諾維信生物技術(shù)有限公司；大麻酚溶液（1 mg/mL）、生育酚（純度≥97%，1 000 IU/g） 美國(guó)Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 中國(guó)試劑網(wǎng)；所有實(shí)驗(yàn)用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SG30-2B型螺旋榨油機(jī) 肇慶市鼎湖景日晟機(jī)械有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；PHS-25C數(shù)字酸度計(jì) 上海大浦儀器有限公司；N24120型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；SX-520-A10-G50-M型芯式過(guò)濾器 上海薩爾設(shè)備有限公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；SU-8010場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、ES-2030型冷凍干燥儀、E-1010型離子濺射鍍膜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

稱取一定量的漢麻籽仁，水分調(diào)節(jié)至4%，榨膛溫度50 ℃，壓力3.5 MPa，計(jì)量低溫初榨毛油，測(cè)定初榨餅中含油質(zhì)量。將初榨餅粉碎，過(guò)60 目篩，為使其在低溫條件下出油，加入3.0% Viscozyme L植物水解酶進(jìn)行酶解，用PBS調(diào)節(jié)至pH 4.8，恒定溫度50 ℃，保持時(shí)間4.5 h后，加入纖維素酶破壞漢麻籽中的纖維，再加Protex 6L堿性蛋白酶充分混合，使其破壞油脂與蛋白的結(jié)合，用PBS調(diào)節(jié)至pH 8.0進(jìn)行酶解，在壓力3.5 MPa、溫度50 ℃條件下進(jìn)行壓榨。本實(shí)驗(yàn)以出油效率為指標(biāo)，研究加酶量、pH值、時(shí)間、溫度對(duì)酶解的影響，并對(duì)漢麻籽油基本理化指標(biāo)和功能性成分進(jìn)行分析。

1.3.2 Protex 6L堿性蛋白酶酶解初榨餅單因素試驗(yàn)

研究漢麻籽油在酶解低溫壓榨工藝中酶解參數(shù)的優(yōu)化，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇加酶量、pH值、時(shí)間和溫度4 個(gè)因素對(duì)初榨餅酶解低溫壓榨進(jìn)行單因素試驗(yàn)。選擇酶解工藝優(yōu)化的條件分別為：堿性蛋白酶加酶量1.2%、pH 10.5、時(shí)間3 h、溫度50 ℃。在榨膛壓力3.5 MPa條件下，研究堿性蛋白酶加酶量分別為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6% 時(shí)對(duì)出油效率的影響；研究酶解pH值分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5時(shí)對(duì)出油效率的影響；研究酶解時(shí)間分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h時(shí)對(duì)出油效率的影響；研究酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時(shí)對(duì)出油效率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)[26]，以加酶量（A）、pH值（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D）為優(yōu)化條件，以出油效率（R）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.4 冷榨餅掃描電鏡樣品制備與觀察

將低溫初榨餅和酶解低溫復(fù)榨餅分別切成2.0 mm×3.0 mm條形，加入2.5%、pH 6.8戊二醛油狀液體，并置于4 ℃冰箱中固定1.5 h。取出樣品后用0.1 mol/L、pH 6.8的PBS沖洗3 次，每次10 min。再分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%的乙醇溶液進(jìn)行脫水各1 次，每次12 min；無(wú)水乙醇脫水2 次，每次12 min。置換方法采用無(wú)水乙醇-叔丁醇（體積比1∶1）和叔丁醇各1 次，每次15 min。然后將樣品放入-20 ℃的冰箱中冷凍30 min，取出后再進(jìn)行冷凍干燥4 h。鍍金膜厚度100～150 ?。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

各指標(biāo)測(cè)定分別參照GB 5009.236—2016《動(dòng)植物油脂水分及揮發(fā)物的測(cè)定》、GB 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》、GB 5009.227—2016《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》、GB/T 14488.1—2008《植物油料 含油量測(cè)定》、GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測(cè)定》。

漢麻籽油植物大麻素測(cè)定參照Citti等[27]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 初榨餅的殘油率

經(jīng)過(guò)低溫初榨后，測(cè)得初榨餅的殘油率為21.6%。

2.2 Protex 6L堿性蛋白酶酶解初榨餅單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對(duì)出油效率的影響

圖 1 加酶量對(duì)出油效率的影響Fig. 1 Effect of enzyme amount on oil yield

從圖1可以看出，隨著堿性蛋白酶的增加，出油效率隨之上升，當(dāng)堿性蛋白酶增加量過(guò)大時(shí)，出油效率反而下降。當(dāng)堿性蛋白酶的使用量為1.0%，出油效率達(dá)到最大值，這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)隨著加酶量的增加，有更多的酶分子和底物相互作用，從而增加出油效率，但是當(dāng)加酶量過(guò)大時(shí)，底物逐漸被酶所飽和，剩余的酶分子沒(méi)有底物可以利用，同時(shí)酶的活性中心會(huì)被其他過(guò)量的酶所覆蓋，影響酶解效率[28]，使得出油效率不再增加而趨于平穩(wěn)，所以本實(shí)驗(yàn)選取加酶量1.0%作為后續(xù)研究參數(shù)。

2.2.2 酶解pH值對(duì)出油效率的影響

圖 2 pH值對(duì)出油效率的影響Fig. 2 Effect of pH on oil yield

從圖2可以看出，pH值在9.0～10.0，出油效率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在pH值到達(dá)10.0時(shí)，出油效率達(dá)到最大，當(dāng)pH值大于10.0時(shí)，出油效率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)槊笇?duì)反應(yīng)體系的pH值有一定的敏感性，pH值可以改變酶分子的空間構(gòu)象，并影響酶分子與底物之間的結(jié)合，當(dāng)pH值為10.0時(shí)，可使酶的活性位點(diǎn)外露，增加酶活力，使得出油效率達(dá)到最高。所以本實(shí)驗(yàn)選取pH 10.0作為后續(xù)研究參數(shù)。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)出油效率的影響

圖 3 酶解時(shí)間對(duì)出油效率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis time on oil yield

從圖3可以看出，在酶解時(shí)間1.5～2.5 h的范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，出油效率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，酶解2.5 h時(shí)出油效率達(dá)到最大值，隨后趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶分子與底物可以充分接觸，進(jìn)行酶解反應(yīng)。但是，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)大多數(shù)底物已經(jīng)被酶解，致使其出油效率增加緩慢，從生產(chǎn)效率上講，時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使生產(chǎn)效率降低[29]。所以本實(shí)驗(yàn)選最適酶解2.5 h作為后續(xù)研究參數(shù)。

2.2.4 酶解溫度對(duì)出油效率的影響

圖 4 酶解溫度對(duì)出油效率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on oil yield

從圖4可以看出，出油效率呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度小于50 ℃時(shí)，出油效率隨著酶解溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)酶解溫度超過(guò)50 ℃后出油效率明顯下降。這主要是因?yàn)槊附鉁囟壬呖梢允狗磻?yīng)體系中分子運(yùn)動(dòng)速率上升，提升了底物和酶的接觸幾率，加速酶解反應(yīng)進(jìn)程；但是酶解溫度過(guò)高會(huì)使維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷裂，使其部分失活，從而降低了酶活性，延緩了酶解進(jìn)程，使得出油效率下降，所以本實(shí)驗(yàn)選取酶解溫度為50 ℃作為后續(xù)研究參數(shù)[30]。

2.3 二次回歸方程的建立分析與驗(yàn)證

表 2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken design with experiment results for response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，將數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到出油效率（R）與加酶量、pH值、時(shí)間、溫度的二次響應(yīng)面回歸方程為：

R=63.6+2.00A+0.75B+2.08C+1.83D+0.50AB+1.25AC+0.75AD-0.25BC-1.00BD+0.75CD-2.80A2-1.92B2-2.93C2-2.55D2

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

由表3可知，回歸方程的因變量與自變量之間存在的線性關(guān)系明顯，整體模型的P值小于0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.709 2，失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型選擇正確，模型中的調(diào)整系數(shù)R2Adj為97.64%，說(shuō)明97.64%的響應(yīng)值變化可以通過(guò)模型進(jìn)行解釋，相關(guān)系數(shù)R2為98.82%，表明該模型與試驗(yàn)擬合良好，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

圖 5 酶解參數(shù)交互作用對(duì)漢麻籽出油效率的影響Fig. 5 Response surface plots showing the effect of interaction between hydrolysis parameters on oil yield

從圖5可以看出，4 個(gè)變量在兩兩交互時(shí)，保持其中2個(gè)變量不變，隨著另外2 個(gè)變量的增加，出油效率呈現(xiàn)先上升的趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)又呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。其中隨著AC、BD、AD、CD交互作用為極顯著，BC和AB不顯著，通過(guò)優(yōu)化得到漢麻籽仁初次冷榨餅酶解過(guò)程的最佳工藝參數(shù)為加酶量1.11%、pH 10.05、時(shí)間2.77 h，溫度52.50 ℃，該條件下出油效率預(yù)測(cè)值為65.20%。根據(jù)實(shí)際情況將工藝參數(shù)進(jìn)行整理，得出整理值為加酶量1.1%、pH 10.0、酶解時(shí)間2.8 h、酶解溫度52 ℃。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，該條件下出油效率平均值為65.0%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合性，從而證實(shí)了模型的有效性。

2.4 低溫初榨餅酶解效果掃描電鏡分析

由圖6A可見(jiàn)，漢麻籽仁經(jīng)過(guò)低溫初榨后，微觀組織結(jié)構(gòu)在榨膛機(jī)械力作用下發(fā)生了一定的變形和破裂，為酶制劑滲透及酶解創(chuàng)造了有利條件。低溫初榨餅經(jīng)過(guò)Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L堿性蛋白酶酶解后（圖6B），細(xì)胞壁受到水解性破壞，細(xì)胞內(nèi)部分油體及蛋白體外露，圖中可見(jiàn)，低變性蛋白體發(fā)生結(jié)構(gòu)性破壞，油體蛋白脫離油體磷脂單分子膜，導(dǎo)致油體開(kāi)放性崩解，油脂明顯聚集溢出，為酶解低溫復(fù)榨創(chuàng)造了有利條件。

2.5 漢麻籽油指標(biāo)分析

表 4 漢麻籽油基本理化指標(biāo)分析Table 4 Physicochemical properties of hemp seed oils

表4數(shù)據(jù)顯示，酶解低溫復(fù)榨漢麻籽油的理化特征指標(biāo)與低溫復(fù)榨（對(duì)照組）比較，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果表明，酶解低溫復(fù)榨工藝方法對(duì)漢麻籽油基本理化指標(biāo)沒(méi)有明顯的影響。

表 5 漢麻籽油功能性成分分析Table 5 Analysis of functional components of hemp seed oils

從表5可以看出，低溫復(fù)榨漢麻籽油中植物大麻素含量為124.56 mg/kg，酶解低溫復(fù)榨漢麻籽油中植物大麻素含量為130.89 mg/kg，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。酶解低溫復(fù)榨與對(duì)照組比較植物大麻素的含量略有提高，表明酶解低溫復(fù)榨工藝方法有利于植物大麻素向油相的遷移。

低溫復(fù)榨漢麻籽油中生育酚的含量為698.27 mg/kg，酶解低溫復(fù)榨漢麻籽油中生育酚含量為715.18 mg/kg，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。分析認(rèn)為，Viscozyme L植物水解酶的預(yù)酶解導(dǎo)致漢麻籽細(xì)胞壁水解，生育酚與多糖的絡(luò)合作用減弱，從而增強(qiáng)了向油相的遷移，釋放出更多的生育酚。

3 結(jié) 論

在響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化條件下，對(duì)殘油率為21.6%的漢麻籽仁低溫初榨餅進(jìn)行酶解低溫復(fù)榨，獲得的出油效率為65.0%；經(jīng)過(guò)Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L堿性蛋白酶酶解后，掃描電鏡觀察到初榨餅粉細(xì)胞壁破壞和油脂溢出聚集明顯，這種狀態(tài)有利于提高壓榨過(guò)程中油脂的流動(dòng)性；酶解低溫復(fù)榨漢麻籽油的基本理化指標(biāo)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），植物大麻素及生育酚含量增加。酶解低溫榨取漢麻籽油，借助Viscozyme L植物水解酶破壞初榨餅粉的細(xì)胞壁纖維網(wǎng)絡(luò)，暴露其內(nèi)部的蛋白體與油體蛋白，利用Protex 6L堿性蛋白酶降解蛋白，釋放油脂，通過(guò)低溫壓榨制取漢麻籽油，該工藝方法具有出油效率高、理化指標(biāo)穩(wěn)定、功能性成分對(duì)油相的分配增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以替代常規(guī)低溫壓榨或低溫復(fù)榨提取漢麻籽油的方法。