用于高果糖漿制備的宛氏擬青霉嗜熱嗜酸菊粉酶酶學(xué)特性分析

高兆建，王先鳳，蘆 寧，李寶林，張抗震，許 祥，陳雪蓮

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇智薈生物科技有限公司，江蘇 徐州 221018；3.江蘇太合食品有限公司，江蘇 徐州 221018）

菊粉又名菊糖，是一種生物多糖，是由D-呋喃果糖以β-(2,1)糖苷鍵連接而成的一種果聚糖，廣泛存在于菊芋、大麗花塊根及萵苣根等植物組織中[1-2]。菊糖因其來源廣泛，價(jià)格相對(duì)便宜，是一種優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)果葡糖漿的原料，具有很高的商業(yè)價(jià)值[3]。果糖相較于蔗糖生產(chǎn)果葡糖漿更具有技術(shù)優(yōu)勢(shì)，因此導(dǎo)致了全球?qū)切枨蟮脑黾印Ｈ缃窬仗堑乃猱a(chǎn)物果糖正逐漸廣泛替代蔗糖成為碳酸軟飲料、水果飲料、酸奶、冰淇淋、烘焙食品、布丁、乳制品和嬰兒食品的重要甜味劑，菊糖在生物能源中也有著廣泛的應(yīng)用前景[4]。

純果糖和果葡糖漿都可以通過菊糖水解制得[5]，水解方法包括酶法水解和酸解。果糖和低聚果糖都能使用菊粉酶水解菊糖或通過酸解獲得，而酸解法在水解過程中，會(huì)產(chǎn)生不具有甜味的二果糖苷以及棕色產(chǎn)物[6]，降低果糖得率。通過酶解法可以克服以上缺點(diǎn)，以淀粉為原料通過α-淀粉酶、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶及葡萄糖異構(gòu)酶制備[6]，但該方法制備繁瑣，成本高，得率低。利用菊粉酶水解菊糖一步反應(yīng)即可達(dá)到果糖產(chǎn)率95%以上，因此利用菊粉酶水解菊糖制備果糖是目前最為理想的途徑。

近些年，有很多產(chǎn)生菊粉酶的微生物研究報(bào)道，這些微生物有擴(kuò)展青霉菌（Penicillium expansum SK16）、黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、史氏芽孢桿菌（Bacillus smithii）、黑曲霉（Aspergillus niger）等[7]，并且對(duì)微生物所產(chǎn)菊粉酶進(jìn)行了不同層面的研究，包括菊粉酶的菌株篩選、菌株誘變選育[8]、發(fā)酵優(yōu)化生產(chǎn)[9-11]、分離純化[12]、酶學(xué)性質(zhì)[13]等。然而已報(bào)道菊粉酶能夠滿足工業(yè)化果糖生產(chǎn)需求的極少，原因較多，其中菊粉酶不能耐受水解菊糖制備果糖時(shí)的高溫高酸環(huán)境是限制菊粉酶應(yīng)用的重要障礙。

本實(shí)驗(yàn)室分離到1 株高產(chǎn)菊粉酶的宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii）菌株，所產(chǎn)菊粉酶高溫高酸環(huán)境下穩(wěn)定性強(qiáng)、活性高。能夠在pH 4.0、溫度60 ℃下進(jìn)行高效菊糖水解反應(yīng)，有望在果糖的工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。本研究主要從菌株發(fā)酵液中分離純化菊粉酶，并對(duì)菊粉酶的水解特性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)深入研究，旨在為應(yīng)用于高果糖漿制備所使用的菊粉酶來源提供新途徑，為菊粉酶的高效應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌種宛氏擬青霉XS27由實(shí)驗(yàn)室篩選得到，4 ℃封蠟保存。

菊糖、果糖 美國(guó)Sigma公司；Tris、甘氨酸、低分子質(zhì)量蛋白Marker 上海生工生物工程有限公司；Sephacry S-100、DEAE-Sepharose Fast Flow 瑞典Pharmacia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KTA Explorer100/Explorer10型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；2-DElectrophoresis電泳系統(tǒng) 美國(guó)Hoefer公司；3K30型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；CascadaTMAN型超純水系統(tǒng) 美國(guó)PALL公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；Amicon Ultra-15超濾管 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 菊粉酶的發(fā)酵制備

保藏的宛氏擬青霉XS27劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基，35 ℃活化培養(yǎng)。切取1 cm2菌苔接種于液體種子培養(yǎng)基（菊粉20 g/L、酵母提取物6 g/L、NaNO32 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，調(diào)節(jié)pH 5.0），裝液量為50 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d。以15%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基（菊粉20 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨5 g/L、NH4H2PO45 g/L、NaNO32 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl20.1 g/L，調(diào)節(jié)pH 5.0），37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 d。將得到的發(fā)酵液離心（4 ℃，8 000 r/min）10 min，收集上清液即粗酶液。

1.3.2 菊粉酶活力測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）測(cè)定還原糖的方法測(cè)定菊粉酶活力。取0.8 mL 2 g/100 mL的菊糖溶液（由0.05 mol/L pH 4.0乙酸鈉緩沖液配制），加入適當(dāng)稀釋的酶液0.2 mL，60 ℃孵育15 min；加入2 mL DNS試劑，沸水浴10 min終止酶反應(yīng)，待冷卻后在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。在以上測(cè)定條件下每分鐘從水解菊糖產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 蛋白含量的測(cè)定

蛋白含量測(cè)定采用Bradford法[14]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在試管中加入適當(dāng)稀釋的酶樣品200 μL，加入4 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。柱層析過程中收集液蛋白含量通過280 nm波長(zhǎng)處的吸光度來測(cè)定。

1.3.4 宛氏擬青霉XS27發(fā)酵液中菊粉酶的純化

1.3.4.1 硫酸銨分級(jí)鹽析

將發(fā)酵液離心后得到的上清液放置在磁力攪拌器上，緩慢加入硫酸銨，使溶液的硫酸銨飽和度依次達(dá)到30%、40%、50%、70%、80%、90%，每一級(jí)梯度在4 ℃環(huán)境下靜置6 h后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，收集沉淀，將沉淀溶解于0.02 mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液中，并用相同的緩沖液4 ℃充分透析約12 h，測(cè)定酶活力和蛋白含量。

1.3.4.2 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析

用0.02 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液平衡DEAESepharose FF離子交換層析柱（26 mm×20 cm）12 h，取透析后的粗酶液上樣，線性洗脫溶液為0～0.8 mol/L NaCl溶液（0.02 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液配制）。洗脫流速為1 mL/min，每管收集體積為3 mL，測(cè)定各收集管菊粉酶活力和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。收集有較高酶活力管中的酶液，超濾濃縮后進(jìn)行分子篩凝膠過濾層析。

1.3.4.3 Sephacry S-100分子篩凝膠過濾層析

將離子交換層析后的菊粉酶超濾濃縮液上樣至Sephacry S-100分子篩層析柱，以0.02 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.0）洗脫，流速0.5 mL/min，2 mL/管收集流出液，該純化過程的洗脫結(jié)束后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)菊粉酶純化情況。

1.3.5 SDS-PAGE分析

以SDS-PAGE法檢測(cè)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和分離純化過程中每一步的蛋白純度。濃縮膠5%，電泳電壓80 V；分離膠10%，電泳電壓120 V。1.3.6 菊粉酶酶學(xué)特性分析

1.3.6.1 最適pH值及酸堿穩(wěn)定性的分析

在60 ℃條件下測(cè)定菊粉酶在pH 3.0～9.0時(shí)的活力，確定菊粉酶的最適pH值。將酶液用0.2 mol/L不同pH值（3.0～11.0）的緩沖溶液（醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 3.0～6.0，磷酸鹽緩沖液pH 7.0～8.0，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH 9.0～11.0）進(jìn)行適當(dāng)稀釋，30 ℃處理3 h后，在60 ℃、pH 4.0條件下測(cè)定剩余酶活力，考察酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.3.6.2 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性的分析

將純化所得的菊粉酶在最適pH值條件下，以菊糖為底物，分別在不同溫度（20～80 ℃）反應(yīng)，測(cè)定菊粉酶活力，每組做3 個(gè)重復(fù)，以活力最高值為100%，以相對(duì)活力對(duì)相應(yīng)的溫度作圖。將菊粉酶放在不同溫度（30～90 ℃）水浴處理60 min，在最適pH值及溫度條件下測(cè)定菊粉酶活力，考察酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.6.3 金屬離子及抑制劑對(duì)菊粉酶活力的影響

在菊粉酶液中加入不同的金屬離子，使其最終濃度分別為10 mmol/L和20 mmol/L，室溫靜置30 min，然后測(cè)定菊粉酶活力。所選鹽類包括MgSO4·7H2O、MnSO4、CuSO4、ZnCl2、CaCl2、FeSO4、Fe2(SO4)3、HgCl2、CoCl2、BaCl2、NiCl2、KCl、NaCl。以不加金屬鹽作為空白對(duì)照。

將菊粉酶與不同濃度的抑制劑混合，同樣在室溫靜置30 min，然后測(cè)定菊粉酶活力。抑制劑包括EDTA、PMSF、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、SDS、Tween 80、Triton X100和乙醇。以不加任何抑制劑作為空白對(duì)照。

1.3.6.4 菊粉酶催化菊糖水解后的產(chǎn)物薄層層析

菊粉酶催化菊糖水解得到的水解產(chǎn)物通過薄層層析分析。適當(dāng)稀釋的酶液100 μL與900 μL 2 g/100 mL的菊糖溶液混合，60 ℃孵育10 h。水解產(chǎn)物上樣至薄層層析板，層析缸中展開，展開后，噴顯色劑，再將薄層層析板105 ℃保溫10 min顯色。層析中所用展開劑正丁醇、異丙醇、乙酸和水按照體積比7∶5∶2∶4混合，顯色劑正丁醇、乙醇、水、磷酸按照體積比80∶8∶5∶7混合。

1.3.6.5 菊粉酶的動(dòng)力學(xué)分析

以菊糖為底物，在0.2～1 mmol/L的濃度下，測(cè)定菊粉酶水解菊糖的初速度。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)定Km和Vmax值，根據(jù)米氏方程的雙倒數(shù)表達(dá)式，以1/[S]為橫坐標(biāo)，以1/[V]為縱坐標(biāo)作圖。根據(jù)直線的縱截距可求出Vmax值，再由斜率計(jì)算得到Km值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果以 ±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Microsoft Excel軟件繪制曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉酶的柱層析分離純化

經(jīng)過硫酸銨梯度鹽析，確定40%～60%的硫酸銨飽和度下所沉淀菊粉酶活力最高。經(jīng)以上硫酸銨飽和度沉淀后的粗酶溶解、透析后上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱，釆用0～0.8 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫。檢測(cè)到有酶活力的收集管對(duì)應(yīng)NaCl洗脫濃度為0.6～0.77 mol/L?？梢钥闯觯辗勖冈趐H 6.0緩沖溶液中，能夠結(jié)合到離子交換介質(zhì)上。通過不同的鹽離子濃度，可以有效同大部分雜蛋白分開，并將粗酶液中的色素去除。離子交換層析后，酶液比活力為52.07 U/mg，純化倍數(shù)為6.02 倍，回收率為62.31%。整體看離子交換層析純化效率高，整體純化情況結(jié)果見表1。收集以上離子交換層析的活力蛋白峰，合并收集管，超濾濃縮后上樣Sephacry S-100分子篩層析柱。經(jīng)分子篩層析去除了大部分蛋白質(zhì)，活性峰偏后，說明菊粉酶分子質(zhì)量偏大。經(jīng)過分子篩層析后，酶比活力顯著增加至327.4 U/mg，純化倍數(shù)為37.85，回收率為51.52%。收集活性峰收集管，SDS-PAGE檢測(cè)純化情況，并進(jìn)一步測(cè)定理化特性。

表 1 從宛氏擬青霉XS27發(fā)酵液中分步純化菊粉酶的情況Table 1 Summary of purification steps for inulinase from P. variotii XS27

2.2 純化過程蛋白的SDS-PAGE分析

圖 1 菊粉酶純化過程中SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis in the purification process of inulinase

如圖1所示，硫酸銨沉淀后經(jīng)透析樣品含有最多的蛋白條帶，說明雜蛋白含量很高；經(jīng)過離子交換層析后的樣品，蛋白條帶顯著降低，但仍有多條蛋白帶存在，說明離子交換層析對(duì)分離雜蛋白效果顯著，但也沒有得到單一的蛋白；再次經(jīng)過分子篩凝膠過濾層析后，得到單一蛋白條帶，表明純化后的幾丁質(zhì)酶達(dá)到電泳純，同時(shí)說明菊粉酶為單一亞基。對(duì)比樣品蛋白質(zhì)相對(duì)遷移距離與已知分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移距離，計(jì)算得到菊粉酶的分子質(zhì)量為62 kDa。

2.3 純化菊粉酶酶學(xué)特性分析

2.3.1 酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

如圖2所示，在pH 2.0～4.0之間，菊粉酶活力隨著pH值的升高而快速上升，pH 4.0時(shí)達(dá)到最高值，隨后隨著pH值的升高而酶活力逐漸下降，當(dāng)pH值超過7.0時(shí)，酶活力急速降低。表明菊粉酶在酸性條件下活力較高，最適pH值為4.0。

圖 2 pH值對(duì)酶活力的影響Fig. 2 Effect of pH on inulinase activity

圖 3 pH值對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effect of pH on inulinase stability

由圖3可知，菊粉酶具有很寬的pH值穩(wěn)定性范圍，在pH值為3.5～10.0時(shí)，殘余酶活力均能達(dá)到80%以上；pH值低于3.5和超過10.5則變得不穩(wěn)定，pH值超過10.5時(shí)，殘余酶活力急速下降。該酶有良好的pH值穩(wěn)定性，在工業(yè)生產(chǎn)中有良好的發(fā)展前景。

2.3.2 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

在20～35 ℃范圍內(nèi)，菊粉酶的活力隨著溫度的升高而緩慢增加（圖4），35～40 ℃之間，酶活力迅速增加，45～65 ℃之間，酶活力均比較高，均保持在90%以上，在60 ℃時(shí)，酶活力最高。65 ℃以上，隨著溫度的上升而快速下降。即最適溫度為60 ℃。

圖 5 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of temperature on inulinase stability

將菊粉酶液在30～90 ℃之間的不同溫度下保溫1 h后，再用pH 4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，溫度為60 ℃條件下測(cè)定菊粉酶的活性，如圖5所示，在30～80 ℃范圍內(nèi)，菊粉酶均能保持較高活力，當(dāng)溫度高于80 ℃處理后的酶液，活性開始迅速下降。在70 ℃以下，保溫1 h后，殘余酶活力均能保持80%以上。

2.3.3 不同金屬離子和抑制劑對(duì)菊粉酶活力的影響

表 2 金屬離子對(duì)酶活力的影響Table 2 Effect of metal ions on inulinase activity

如表2所示，Mg2+、Mn2+、Ca2+在10 mmol/L和20 mmol/L濃度下對(duì)菊粉酶活力有強(qiáng)烈的激活作用，Ca2+對(duì)酶的激活作用最為明顯，在10 mmol/L濃度下相對(duì)酶活力高達(dá)134.13%；Hg2+在10 mmol/L和20 mmol/L濃度下對(duì)菊粉酶活力有強(qiáng)烈抑制作用，在20 mmol/L濃度下抑制作用最為明顯，測(cè)定酶活力為31.21%；Ni2+在10 mmol/L濃度下對(duì)菊粉酶活力有一定的抑制作用，隨著離子濃度升高對(duì)菊粉酶活力抑制作用增強(qiáng)；Fe2+、Fe3+、Ba2+、K+、Na+、Co2+、Zn2+在10 mmol/L和20 mmol/L下對(duì)菊粉酶活力無明顯影響。

如表3所示，金屬螯合劑EDTA對(duì)菊粉酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，10 mmol/L濃度下，殘余酶活力為75.6%；還原劑β-巰基乙醇和DTT在1 mmol/L濃度下，對(duì)酶活力有顯著抑制作用，β-巰基乙醇抑制率達(dá)到33%；而表面活性劑SDS、Tween 80和Triton X100對(duì)酶活力基本沒有影響；有機(jī)溶劑乙醇在3 個(gè)檢測(cè)體積分?jǐn)?shù)下均沒有抑制作用。2.3.4 菊粉酶催化菊糖水解產(chǎn)物薄層層析

表 3 不同抑制劑、表面活性劑及乙醇對(duì)酶活力的影響Table 3 Effects of different inhibitors, surfactants and alcohols on inulinase activity

采用薄層色譜進(jìn)行定性分析，檢測(cè)其能否催化菊糖生成果糖，如圖6所示，菊糖經(jīng)過菊粉酶10 h的水解作用，幾乎全部被完全水解消化，得到單一的果糖水解產(chǎn)物。表明從宛氏擬青霉XS27發(fā)酵液中分離純化的菊粉酶能夠特異性地從非還原性末端水解菊糖，釋放出果糖。

圖 6 菊粉酶催化菊糖水解產(chǎn)物薄層層析Fig. 6 Thin layer chromatograms of inulin hydrolysates formed by inulinase

2.3.5 菊粉酶動(dòng)力學(xué)分析

圖 7 菊粉酶的Lineweaver-BurkFig. 7 Lineweaver-Burk plot for inulinase

將稀釋的菊粉酶純酶液分別與不同濃度的菊糖底物反應(yīng)，測(cè)定生成的還原糖量。根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法（圖7），分別求出酶的Km值及Vmax值，菊粉酶的Km值為5.93 μmol/L，Vmax為75.18 μmol/（min·L）。

3 討 論

國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了不同微生物來源的菊粉酶，發(fā)酵所得菊粉酶活力區(qū)別較大。如Singh等[15]以草酸青霉（Penicillium oxalicum）BGPUP-4為菌株經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化后最高酶活為38.52 U/mL；Paix?o等[1]以拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）為菌株以菊芋汁為最佳培養(yǎng)基發(fā)酵后菊粉酶活力8.67 U/mL，Chesini等[16]報(bào)道了從白曲霉（Aspergillus kawachii）中克隆菊粉酶基因并在巴斯德畢赤酵母中成功表達(dá)，發(fā)酵72 h產(chǎn)酶量達(dá)到840 U/mL。本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的宛氏擬青霉XS27為菌種，未經(jīng)深入發(fā)酵條件優(yōu)化的菊粉酶產(chǎn)量為56.7 U/mL。同報(bào)道的非基因重組表達(dá)菌株相比，產(chǎn)酶量處于較高水平，但與基因重組超表達(dá)的菊粉酶產(chǎn)量相比較低。故本實(shí)驗(yàn)室接下來將在克隆菌株菊粉酶基因以及異源菌株重組高效表達(dá)方面將深入開展工作，擬大幅度提高酶產(chǎn)量。

此外，從發(fā)酵液中分離純化菊粉酶并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)研究，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮見從宛氏擬青霉發(fā)酵液中分離純化菊粉酶的報(bào)道。本研究中層析純化菊粉酶的方法，純化效率高，不僅得到了電泳純的菊粉酶，而且回收率達(dá)到51%以上，菊粉酶比活力達(dá)327.4 U/mg，純化倍數(shù)為37.85。有效避免了酶的損失，而且還提高了菊粉酶活力，這為研究酶學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。純化的菊粉酶為單亞基蛋白，分子質(zhì)量62 kDa，相比較來源于Streptomyces sp.（45 kDa）[12]的菊粉酶分子質(zhì)量偏大，但同來源于Cryptococcus aureus G7a[17]的菊粉酶分子質(zhì)量相類似。

本研究純化到的菊粉酶同所報(bào)道的菊粉酶相比，顯著優(yōu)勢(shì)是酶的最適作用溫度高，在40～65 ℃范圍內(nèi)，酶都具有較高的催化效率，酶活保持在80%以上，最適溫度為60 ℃。而報(bào)道菊粉酶最適作用溫度幾乎都在60 ℃以下，如Sphingobacterium sp. GN25[8]、Aspergillus niger AF10[18]、Arthrobacter sp. S37[19]等來源的菊粉酶最適作用溫度均在30～55 ℃之間。將酶在不同溫度下保溫1 h后檢測(cè)，在高達(dá)70 ℃條件下，殘余酶活能保持80%以上，表明菊粉酶具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。在以菊粉為原料酶法生產(chǎn)果葡糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)中，通常需要在高溫下進(jìn)行，本研究的宛氏擬青霉菊粉酶具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

對(duì)菊粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，在pH 3.5～10.0范圍內(nèi)孵育3 h，殘余酶活均在80%以上。在pH 3.5～6.5之間，菊粉酶都能保持高的酶解活力，pH 4.0時(shí)酶活力最高，與報(bào)道的Kluyveromyces marxianus[20]、Arthrobacter sp. S37[19]來源的菊粉酶相類似，但低于Pichia guilliermondii[21]、A. niger[22]等來源的菊粉酶。菊粉酶在低pH值環(huán)境下維持高活力，對(duì)工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義：一方面菊粉經(jīng)常用作生產(chǎn)果糖糖漿，果糖在酸性條件下可以維持高穩(wěn)定性，因此水解過程在酸性條件下進(jìn)行；另一方面通過酶法水解菊粉質(zhì)原料通常時(shí)間較化學(xué)法時(shí)間長(zhǎng)，容易受到微生物的污染，較酸的水解環(huán)境可以抑制微生物的污染；其三，菊粉在植物塊莖中通常不以單一的成分存在，同時(shí)還有多種淀粉類成分，因此在對(duì)粗加工的菊粉原料糖化處理時(shí)，需要加入多種淀粉酶，多種酶共同作用，徹底水解大分子多糖。在酸性的糖化環(huán)境下，可以有效抑制副產(chǎn)物如麥芽酮糖的產(chǎn)生[23]，提高單糖得率。因此，本研究的菊粉酶可以和其他淀粉酶配合使用，提高淀粉質(zhì)原料的水解率。

金屬離子有些對(duì)酶活力有激活作用，有些有抑制作用。Mg2+、Mn2+和Ca2+是菊粉酶的激活劑，特別是Ca2+在低濃度對(duì)酶的激活非常顯著，與報(bào)道的A. niger[18]來源菊粉酶一致。Hg2+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用，這可能是酶蛋白中含有對(duì)酶活力具有重要作用的SH基團(tuán)，Hg2+對(duì)菊粉酶的抑制作用在其他微生物來源的菊粉酶中也有發(fā)現(xiàn)[24]。

抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑對(duì)酶活力基本沒有影響，因此菊粉酶可以添加到洗滌劑中，增強(qiáng)洗滌效果。菊粉酶在10%～30%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，酶催化活性沒有降低，表明酶的乙醇耐受性較好，因此宛氏擬青霉菊粉酶可用于乙醇發(fā)酵中菊糖的邊糖化邊發(fā)酵工藝。

薄層層析表明，酶催化菊糖的水解產(chǎn)物幾乎全部為果糖，沒有其他副產(chǎn)物產(chǎn)生，說明本研究中宛氏擬青霉XS27發(fā)酵得到的菊粉酶能夠非常專一性地從菊糖末端逐一水解果糖單位，得到單一的果糖終產(chǎn)物，這與報(bào)道的大多數(shù)菊粉酶相一致[25]，如白曲霉（Aspergillus kawachii）[16]、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）[26]、節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）[4]、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）[27]等來源的菊粉酶均是專一性的外切型菊粉酶。因此宛氏青霉菊粉酶可在食品醫(yī)藥行業(yè)中用于果糖及低聚果糖的生產(chǎn)。

不同來源的菊粉酶對(duì)菊糖的Km差異較大，如Mohamed等[24]純化的寡孢根霉菌（Rhizopus oligosporus）菊粉酶Km值為0.93 μmol/L，Chesini等[16]報(bào)道的重組工程菌所產(chǎn)菊粉酶Km值1.35 μmol/L，Karimi等[28]報(bào)道的黑曲霉菊粉酶Km為0.25 μmol/L，Ohta等[29]分離的根霉菌菊粉酶Km為9.0 μmol/L，Chen Xiaoming等[30]基因重組表達(dá)的菊粉酶Km為7.1 μmol/L，Moriyama等[31]報(bào)道來源于青霉的菊粉酶Km值為92.6 μmol/L。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得宛氏擬青霉XS27所產(chǎn)菊粉酶Km值為5.93 μmol/L，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的菊粉酶Km相比，處于比較低的水平，顯示宛氏擬青霉XS27所產(chǎn)菊粉酶對(duì)菊糖的親和力較好，更適合于高果糖漿的制備。

4 結(jié) 論

以宛氏擬青霉XS27為菌種，經(jīng)過初步的三角瓶液體發(fā)酵，以菊糖為底物，最適水解條件下，檢測(cè)菊粉酶活力達(dá)到56.7 U/mL。在均以菊糖為底物、最適酶解條件及相同的酶活力單位計(jì)算方法情況下，對(duì)比國(guó)內(nèi)外菊粉酶發(fā)酵活力發(fā)現(xiàn)，本研究的菊粉酶產(chǎn)量在非重組菌株中處于較高水平。采用離子交換層析、分子篩過濾層析等方法從宛氏擬青霉XS27發(fā)酵液中純化到了電泳純的菊粉酶并對(duì)酶的性質(zhì)進(jìn)行研究。純化酶比活力為327.4 U/mg，純化倍數(shù)37.85，回收率達(dá)到51.52%。對(duì)比國(guó)內(nèi)外菊粉酶純化方法，本研究的純化體系從酶的純化倍數(shù)及酶活力的回收率來看都具有顯著優(yōu)勢(shì)。此外，由于該純化方法所需時(shí)間短，工藝操作簡(jiǎn)單，純化效率高，因此可以適用于高純度酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)。菊粉酶具有優(yōu)良的理化特性，在較高的溫度及寬廣的pH值范圍內(nèi)，能保持較高的穩(wěn)定性；在pH 4.0及溫度60 ℃下，水解菊糖活性最佳。因此該酶是一種嗜酸嗜熱型的菊糖專一外切型水解酶。另外，酶對(duì)表面活性劑及乙醇具有較好的耐受性。綜合來看，菊粉酶具有優(yōu)良的理化性質(zhì)，很有希望在食品、醫(yī)藥、日化行業(yè)中用于果葡糖漿制備、淀粉質(zhì)的徹底水解、低聚果糖合成、乙醇發(fā)酵中。